2—酮基—L—古龙酸高产融合子15的形态学及生理生化特征的研究

由地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和２—酮基—Ｌ—古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体融合，得到了既能独立生长传代，又能产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的１５号融合子。其菌落和菌体形态类似于Ｈ１９亲本，其生理生化特性也大多酷似Ｈ１９亲本而不同于Ｓ１９亲本。但其产生２—酮基—Ｌ—古龙酸的特性、乙醇氧化反应、石蕊牛奶产酸以及精氨酸双水解酶阴性等特点又酷似Ｓ１９亲本而不同于Ｈ１９亲本。其氧化酶反应、初始生长ｐＨ范围、苯丙氨酸和色氨酸脱氨酶反应则不同于双亲本。其菌体的氨基酸组份及含量也与双亲有一定差异。

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究 Ⅰ.新组合菌系SCB329-SCB933的生物学特性

采用紫外照射、化学诱变和原生质融合等方法选育到一株性状更优良的突变株SCB329,并与新筛选的一株芽孢杆菌SCB933搭配组成新的组合菌系。产酸小菌SCB329与其亲本菌株氧化葡萄糖酸杆菌性状相似。伴生大菌SCB933属苏芸金芽孢杆菌（B.thuringiensis）。新组合菌系利用L-山梨糖的发酵液提取后经纸层析,元素分析和红外吸收光谱等项鉴定,其发酵产物确系2-酮基-L-古龙酸,对新组合菌系的生物学特性也进行了研究。

从D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸——Ⅰ.菌株的诱变选育和代谢产物的鉴定

2-酮基-L-古龙酸是合成维生素C的前体,以D-葡萄糖为原料经两种微生物串联发酵直接制备。本文报道了用紫外线照射和硝基胍处理等方法对2-酮基-L-古龙酸及其中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)产生菌的诱变选育。葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter sp.)SCB 611在含D-葡萄糖、玉米浆和碳酸钙的培养基中,经48小时培养后,可生成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)。同时也选出了一株欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB 247,它的产酸能力比前者明显要高。棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB 3058在以D-葡萄糖作为氢载体的情况下,经过三天摇瓶发酵,能将经SDS处理的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)有效地转化为2-酮基-L-古龙酸。上述菌株的代谢产物经分离提取后用熔点测定、元素分析、红外和紫外吸收光谱测定等鉴定,可以确证菌株SCB 611或(SCB 247)及菌株SCB 3058的代谢产物分别是2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)和2-酮基-L-古龙酸。

新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的研究Ⅲ.发酵过程的特征和条件控制

在分析了新组合菌系ＳＣＢ３２９－ＳＣＢ９３３发酵过程特征的基础上，对流加发酵工艺中的种子培养、ｐＨ、溶氧的控制，以及发酵液初始培养基中的Ｌ－山梨糖浓度和流加起始点进行了优化，获得了比分批发酵更为满意的结果：发酵最终总糖达１３％（ｗ／ｖ）左右，发酵周期４０～５０ｈ，产２－酮基－Ｌ－古龙酸达１１５－１３０ｍｇ／ｍｌ，克分子转化率达８８ｍｏｌ％左右。

山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律

对山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律进行了初步研究。通过对这一混合发酵体系蛋白和尿素代谢的研究表明,氮源代谢与单一菌体发酵相比有其特殊性,主要表现在尿素的加入有两个作用,即作为生理碱性物质调节体系pH和为菌体代谢提供部分氮源,而体系的蛋白含量随发酵时间的延续不断增加,其增加的原因是巨大芽孢杆菌由营养体转变成芽孢所致,这是该发酵体系的特点。本文还对该发酵体系各种氨基酸变化规律进行了讨论,将一共17种氨基酸按其变化规律分成了三类,较好地解释了各种氨基酸的变化情况,为进一步深入研究该体系的动力学特性提供了数据基础。

膜分离法提纯2-酮基-L-古龙酸的研究

采用超滤膜分离新设备—— Sun- flo超滤膜分离系统一步截留不经预处理的维生素 C发酵液中的菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质 ,滤液质量高 ,过滤收率高达 99.2 4 % .在超滤提纯古龙酸的过程中 ,系统的膜通量可达 99.4 9LMH,且膜通量随超滤时间的延长衰减得极为缓慢 ,表明 Sun- flo超滤膜分离系统完全能克服发酵液不经预处理产生严重膜堵塞的现象 ,大大简化了操作工艺流程 ,降低了生产成本 ,将该系统应用于工业生产 ,在技术上完全可行 。

用原生质体融合技术选育2－酮基－L－古龙酸高产菌株的研究

对革兰氏阳性的地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｈ１９和革兰氏阴性的２－酮基－Ｌ－古龙酸产生菌Ｓ１９的原生质体的制备条件进行了研究，并采用聚乙二醇作诱导剂进行了两菌株的原生质体融合，用链霉素作为抗性标记对融合子进行了选择。从１７株产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子１５号。融合子１５号具有两个亲本菌株所具有的一些特性。

2-酮基-L-古龙酸产生菌原生质体的属间融合

用配对法筛选得一株氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans) 10 - 3的优良伴生菌短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus) 970 0 2。混合菌发酵产生 2 -酮基 - L-古龙酸 ,山梨糖的转化率达 90 %左右。两菌分别经诱变处理 ,获得耐利福平 B.pumilus 970 0 2 - 1- 6 Rifr和耐红霉素 G.oxydans 10 - 3- 2 0 Emr遗传标记菌株。并确定 B.pumilus 970 0 2 - 1- 6Rifr菌原生质体形成和再生最佳条件。初步尝试两菌属间原生质体融合。

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)SCB3 2 9以D 山梨醇为底物培养时可产生微量 2 酮基 L 古龙酸 ;而葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)SCB1 1 0能将D 山梨醇以较高效率转化为L 山梨糖 ,但不产 2 酮基 L 古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养 ,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等 ,确定其主要的代谢产物是 2 酮基 L 古龙酸。

几种外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸的影响

通过在发酵培养基中添加不同的外源营养物质及巨大芽孢杆菌的培养上清液,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的影响。结果表明,添加适量的谷氨酸单钠(MSG)、腺苷三磷酸(ATP)、含氮碱基、二氢叶酸和巨大芽孢杆菌的培养上清液都能够促进菌体增殖并提高2-KGA产量,而且2-KGA产量与生物量呈正相关。巨大芽孢杆菌的培养上清液促进菌体生长和产2-KGA的作用远大于以上各种外源营养物质。添加培养36 h的巨大芽孢杆菌胞外液后,氧化葡萄糖酸杆菌的菌落数和2-KGA产量分别是对照的13.39倍和8.81倍,而添加外源营养物质中促进作用最大的二氢叶酸后仅为对照的4.12倍和2.97倍。这表明,2-KGA产量的增加主要是通过促进氧化葡萄糖酸杆菌的菌体增殖实现,巨大芽孢杆菌的培养上清液促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的机制不同于其他外源营养物质,可能是通过某种生物活性物质提高氧化葡萄糖酸杆菌菌群密度来实现。

维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展

维生素C(Vc)二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。

MgSO4对2-酮基-L-古龙酸发酵影响的实验研究

通过摇瓶实验和2 L搅拌釜式发酵罐实验,研究了发酵培养基中初始MgSO4浓度对维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)发酵过程的影响.实验结果表明:2-KGA发酵的最佳MgSO4初始浓度w0≈0.084%,在这一浓度下,产物2-KGA的得率和容积生产率均达到峰值;MgSO4初始浓度过高将降低产物得率和容积生产率.

混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸研究进展

利用混合菌发酵L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA),再经化学转化合成维生素C(Vc),是我国工业生产Vc的主要途径,具有简化工艺,减少污染,降低能耗等诸多优点。从菌系组合、菌种选育、代谢途径与酶学特性、工程菌构建、伴生作用机制及发酵工艺等方面出发,综述混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-KGA的研究现状和最新进展,并提出进一步研究和探索的方向。

葡萄糖对维生素C二步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

通过在发酵过程中添加适量葡萄糖的方法,对维生素C二步发酵混合菌系生长产酸过程进行了适当的调控。最适加糖调控措施为:装液量为20 mL/250 mL摇瓶,接种量为10%,加糖时间为发酵启动后24 h,加糖量为0.08%,培养温度为29℃。最终调控组与对照组相比糖酸转化率提高了3.02%,发酵周期缩短了4 h。

玉米浆对Vc二步发酵产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

通过在培养基中添加不同量的玉米浆,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌)生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸的影响,并研究玉米浆成分中的12种主要氨基酸对小菌产酸的影响。结果表明:每100 mL发酵培养基中添加2.5 g左右过滤除菌玉米浆时,2-酮基-L-古龙酸产量高达26.84 mg/mL,小菌活菌数为不添加玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。过量玉米浆抑制小菌产酸。12种氨基酸单独与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养及全部混合后与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养对产酸及菌体生长无影响。

L－山梨糖发酵生产2－酮基－L－古龙酸的最佳组合新菌系的生物特性的研究

从２２个不同组合的发酵Ｌ山梨糖生成２－酮基－古龙酸的组合菌系中选出了最佳组合新菌系Ｈ１９Ｓ１９。对该菌系的形态学及生理生化特性的研究表明，其中Ｈ１９为地衣芽枪杆菌（ＢａｃｉｌｌｓＬｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ），是Ｓ１９的伴生菌；Ｓ１９是产生２－酮基－古龙酸的菌株，具有许多特点，其分类位置暂无法确定。

L-山梨糖流加发酵高效生产2-酮基-L-古龙酸

混合菌系氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)能够在长时间内保持较强的代谢活力。在自动控制温度、pH和溶氧的条件下,探索间歇流加L-山梨糖发酵生成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的新工艺。该工艺即充分利用了混合菌系的优良特性,又可解除糖的高浓度对产酸的抑制作用。通过本实验使L-山梨糖的终浓度达到14%,2-KLG产量为130mg/mL左右,转化率达90%,发酵周期40～60h之间。

2-酮基-L-古龙酸转化维生素C钠的研究

利用2-酮基-L-古龙酸与甲醇生成2-酮基-L-古龙酸甲酯,然后加入碳酸钠与2-酮基-L-古龙酸甲酯反应转化为维生素C钠,系统地研究了转化过程中反应温度、反应时间、碳酸钠用量等对转化反应的影响。实验结果表明,碳酸钠可以显著地改善反应的条件,提高维生素C钠质量。在反应温度为62℃时,转化率提高到96.01%。在转化反应中碳酸钠的效果明显优于碳酸氢钠。

2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱测定方法和条件

为了快速准确的检测维生素C（VC）生产工艺中VC的重要前体物2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）浓度,采用高效液相色谱法进行测定,选用6×250 mm Carbohydrate分析柱,乙腈：磷酸二氢钾=60∶40的流动相,在波长210 nm处紫外光检测,控制流速为1 mL/min和温度45℃。结果表明2-KLG在6 min左右出峰,与VC具有较好分离度;2-KLG标准曲线的回归方程为y=0.776x-13.46,相关系数达到99.9%,检出限为0.5 mg/L;回收率为96.3%~104%,RSD为6.28%（n=5）

混菌发酵中与普通生酮基古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸相关功能蛋白的研究

目的:在混菌发酵中,筛选与小菌产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)相关的功能蛋白,并分析蛋白表达量的变化与产2-KGA的关系,寻找影响菌体代谢效率的关键性因素。方法:利用蛋白质组学技术,依据小菌产酸曲线,筛选与小菌产2-KGA有一定相关性的蛋白质,并利用生物信息学数据库,分析其改变与小菌代谢的关联。结果:获得了分辨率和重复性均良好的凝胶蛋白图谱,筛选出与小菌生产2-KGA密切相关的8个蛋白。结论:小菌产2-KGA强度与小菌体内抗氧化蛋白表达水平及糖代谢、能量代谢系统密切相关,推测有活性细胞色素C的含量可能为小菌产2-KGA的限制性因素。