高速逆流色谱法制备分离库拉索芦荟中的2’-对香豆酰芦荟宁

采用高速逆流色谱法分离纯化库拉索芦荟中的2’-对香豆酰芦荟宁。以正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水(1∶5∶1∶5,V/V/V/V)为溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,线圈转速为860 r/min,流速为2 mL/min,紫外检测波长为300 nm,一次进样85 min内从487.5 mg库拉索芦荟丙酮提取物中分离得到19.5 mg单体组分,经高效液相色谱分析,测定纯度为95.6%(峰面积百分比),通过质谱、红外、紫外和核磁技术进行结构鉴定,确定组分为2’-对香豆酰芦荟宁。该法具有操作简便、速度快、样品制备量大、节省溶剂及回收率高等优点,可为芦荟宁类化合物的分离提供高效、稳定及可靠的方法。

尾叶桉GLU4中4-香豆酰辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)是木质素合成中的关键酶,根据植物中4CL保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其4CL基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA长5 534 bp,cDNA长1 640 bp,CDS区编码544个氨基酸。Eu4CL核酸序列与GenBank已登录的桉属植物4CL基因同源性达到98%,与毛竹等其他科属植物4CL的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL结构域及AMP结合位点、CoA结合位点,与土肉桂等植物中4CL基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL基因。对Eu4CL编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对Eu4CL进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到Eu4CL基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。

拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的克隆与生物信息学分析

以拟南芥总RNA为模板,利用RT-PCR的方法从拟南芥中扩增获得一条4-香豆酰-CoA连接酶基因完整的cDNA序列,命名为4CL1。利用生物信息学生物软件对其核酸和蛋白质序列进行分析,结果表明,该序列长1 686bp,与已报道的拟南芥4-香豆酰-CoA连接酶基因的序列相似性达到98%~100%,氨基酸序列相似性为99%~100%;4CL1基因编码561个氨基酸,该氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA连接酶AMP-binding保守结构域LPYSSGTTGLPK,同时含有该蛋白家族的催化活性中心GEICIRG序列;预测的分子量为61.05kDa,理论等电点为5.25,不稳定参数为35.93,在分类上属于稳定性蛋白;二级结构主要以无规则蜷曲、α-螺旋、延伸链及β转角为主,其含量分别为34.22%、30.30%、24.06%和11.41%。

丝瓜果实发育过程中4-香豆酰辅酶A连接酶在管状分子分化中的作用

对丝瓜果实发育过程中４－香豆酰辅酶Ａ连接酶作为初步纯化，并对它的一些理化性质作了研究．结果表明４－ＣＬ含有两个同工酶，酶Ⅰ纯化１５．６８倍含量为２２．６３％；酶Ⅱ纯化４４．２３倍含量为３．９１％．酶Ⅰ对香豆酸和咖啡酸的亲合性大于酶Ⅱ的，酶Ⅰ的最适温度为４０℃，最适ｐＨ为８．０．研究表明４－ＣＬ活性与木质素的生物合成和管状分子分化密切相关，它们之间存在一种顺序关系。

白花蛇舌草2种主要香豆酸类化学成分的含量测定

目的建立同时测定白花蛇舌草中(E)-6-0-P-香豆酰鸡屎藤苷甲酯和香豆酸的方法。方法采用反相高效液相色谱法,Kromasil ODS柱(4.6 mm×250 mm,5μm),乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脱(0 min,20∶80;30 min,30∶70;35 min,60∶40)。检测波长:303 nm,柱温30℃,流速1 mL.min-1。结果白花蛇舌草中(E)-6-0-P-香豆酰鸡屎藤苷甲酯和香豆酸在该条件下有较好的线性关系,当提取溶剂不同时,两者的提取率有较大差异。结论测定方法简便、准确,为白花蛇舌草质量控制提供了可靠的依据;不同提取溶剂试验研究对确立白花蛇舌草最佳提取工艺有一定的参考价值。

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。

2-甲基-3-乙基马来酰亚胺合成及应用研究

采用新颖的合成方法以马来酸酐为原料通过四步反应合成2-甲基-3-乙基马来酰亚胺,所有化合物经过元素分析得到确认。将目标产物应用于卷烟加香评吸试验,结果表明其可以协调香气,丰富及饱满烟草本香,提升烤烟香韵及烟气浓度,改善烤烟品质。合成的该新型香料经审核批准后可作为香原料应用于卷烟加香中。

阳离子香豆胶的合成及结构表征

以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵（HAT）为阳离子醚化剂，天然香豆胶为原料，异丙醇为分散剂制得季铵盐型阳离子香豆胶。研究了HAT、催化剂NaOH、反应温度和反应时间对合成阳离子香豆胶（CFG）的影响，用凯氏定氮法测定了CFG的取代度。合成CFG的优化实验条件为：m（香豆胶）：m（异丙醇）：m（HAT）：m（NaOH）=1：（1．6—2）：（0．15—0．3）：（4—8），反应温度40—50℃，反应时间2—3h，制得的产品能满足工业应用要求的黏度及取代度范围（500，800mPa·s，DS=0．86-1．32）。用FTIR和^13CNMR对CFG的结构进行了表征。

植物脂酰-CoA合成酶基因家族研究进展

脂酰-CoA合成酶在植物的脂肪酸代谢中有非常重要的作用．本文对长链脂酰-CoA合成酶（LACS）与一种新的脂酰-CoA合成酶（ACOS）的基因功能、酶学特性和基因家族表达调控的研究进展进行了综述．

毛白杨4-CL cDNA的克隆、表达及活性分析

从毛白杨(Populus tomentosa)木质化茎中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行cDNA扩增,获得1条1 621 bp的片段。测序结果表明:该片段编码536个氨基酸组成的多肽,序列中包含所有已知4-CL蛋白的2个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。将cDNA克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,4-CL基因在大肠杆菌BL21中获得表达,所表达融合蛋白的分子量约为70 ku。酶活性分析表明:该重组蛋白对底物PA、FA、CA均表现出催化活性,其偏爱性顺序为PA>FA>CA,对SA则没有活性。

草酸与家山黧豆中ODAP生物合成及其抗逆性关系的研究

山黧豆中含β-N-草酰-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-α,β-diaminopropionic,ODAP),ODAP是引起山黧豆中毒的主要成分．在山黧豆不同发育期,用草酸合成抑制剂、外源草酸和水分胁迫等处理后分析各器官中ODAP积累消长动态与山黧豆抗逆性及其产量因子等之间的关系,结果如下:BHB不仅降低了各器官中草酸的质量浓度,而且明显抑制了ODAP积累;外源草酸或水分胁迫处理后,促进了内源草酸和ODAP的积累;BHB在降低了成熟种子中ODAP质量分数的同时,也降低了山黧豆的抗逆性,但在生长后期处理既可抑制种子中ODAP积累,又不致严重影响山黧豆的产量和抗逆性．这表明,草酸是ODAP生物合成的前体物之一,为获得低毒山黧豆提供了一条切实可行而有效的途径．

RP-HPLC测定芫花中山柰酚-3-O-β-D-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷的含量

目的:对芫花中山柰酚-3-O-β-D-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷(tiliroside)的含量进行测定。方法:采用反相高效液相色谱,ZORBAX XDB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为乙腈(A)-0.1%醋酸水溶液(B),梯度洗脱,0～18 min A:B 26∶74,18～33 mim A:B 80∶20;流速1.0 mL.min-1,检测波长310 nm,柱温25℃。结果:山柰酚-3-O-β-D-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷在进样量0.1~5.0μg与峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9(n=6)。山柰酚-3-O-β-D-(6″-P-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷的平均回收率101.50%,RSD 0.90%(n=6)。结论:该方法可准确地测定芫花中山柰酚-3-O-β-D-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷,方法精密度高、简便、快速。

红花籽粕中血清素衍生物的HPLC-MS分析

采用液相色谱质谱联用(HPLC—MS)技术,对红花籽粕粗提物中血清素衍生物组份进行分析, 确定是5-羟色胺与阿魏酸或香豆酸的7种酰胺化产物,包括其二聚体和葡萄糖苷,分别命名为:阿魏酰5- 羟色胺;香豆酰5-羟色胺;香豆酰5-羟色胺二聚体;香豆酰5-羟色胺基阿魏酰5-羟色胺;阿魏酰5-羟色胺二聚体;香豆酰5-羟色胺葡萄糖苷;阿魏酰5-羟色胺葡萄糖苷。

香露兜不同叶位挥发性成分差异性分析

以香露兜(Pandanus amaryllifolius Roxb.)不同叶位叶片组织为材料,采用气相色谱–质谱联用(GC-MS)技术对其挥发性成分进行鉴定,揭示不同叶位挥发性成分组成变化规律。结果表明:香露兜8个不同叶位叶片挥发性成分由呋喃酮类、吡咯类、呋喃类等10类21种物质组成,3-甲基-2(5H)-呋喃酮、新植二烯、2-乙酰-1-吡咯啉、叶绿醇、2,3-二氢苯并呋喃、2,4-二叔丁基酚、羟基丙酮、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯9种共有物质的含量均存在极显著差异(P<0.001)。其中,特征挥发性物质2-乙酰-1-吡咯啉平均含量为(94.00±36.66)μg/g,倒5叶位含量最高(122.99±3.48)μg/g,倒1至倒8叶位整体呈先升高后降低的变化趋势。主成分分析结果表明,倒1叶位主要挥发性成分为3-甲基-2(5H)-呋喃酮、棕榈酸乙酯和甲酸庚酯,倒2、3和4叶位主要挥发性成分为叶绿醇、2-丁基-1-辛醇、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、2-乙酰-1-吡咯啉、2,3-二氢苯并呋喃、新植二烯、角鲨烯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和2,4-二叔丁基酚,倒5叶位主要挥发性成分为2-乙酰-1-吡咯啉、2,3-二氢苯并呋喃和角鲨烯;倒6、7、8叶位主要挥发性成分为角鲨烯、新植二烯、2-乙酰-1-吡咯啉和羟基丙酮。香露兜不同叶位挥发性物质组成及含量存在一定差异,将为其标准化采收提供理论依据。

红花籽粕中两种主要5-羟色胺衍生物分离纯化及NMR结构鉴定

本研究建立了红花籽粕中两种主要5-羟色胺衍生物的分离纯化方法及其HPLC检测方法。采用大孔吸附树脂、LichrospherC18柱层析分离纯化两种化学成分,用HPLC-MS、1H-NMR、13C-NMR对其进行检测鉴定。结果表明,从红花籽粕的乙醇提取物中得到的两种单体分别为:N-阿魏酰5-羟色胺、N-(p-香豆酰)5-羟色胺,其HPLC-PAD归一化纯度分别为96.76%、90.29%。

4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)和聚酮合酶(PKS1)的融合蛋白在莱茵衣藻中表达促进树莓酮积累

树莓酮具有重要的医药价值,如抗流感、预防糖尿病等。为了在莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii中获得树莓酮,本研究将树莓酮合成的最后两个步骤中的酶,即4-香豆酰-Co A连接酶(4-coumaryl-Co A ligase,4CL)和聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS1)通过甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(Gly-Ser-Gly,GSG)三肽接头融合在一起,构建莱茵衣藻表达载体p Chla-4CL-PKS1。通过电转化的方法将由PSAD启动子驱动的融合基因4CL-PKS1插入野生型莱茵衣藻(CC125)和细胞壁缺失型莱茵衣藻(CC425)中。结果在表达4CL-PKS1融合蛋白的野生型莱茵衣藻和细胞壁缺失型莱茵衣藻中,树莓酮含量分别为6.7μg/g (鲜重)和5.9μg/g (鲜重),高于天然植物中树莓酮的含量(2–4μg/g)。

香露兜中2-乙酰-1-吡咯啉的鉴定与定量分析

该试验建立了香露兜中特征香气成分2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的气相色谱-质谱(GC-MS)鉴定、超高效液相色谱(UPLC)定量分析的检测方法。香露兜样品中的2-AP采用6种不同方式对比提取,以GC-MS结合保留指数进行鉴定,再采用高灵敏度的UPLC进行定量分析。结果表明,超声波辅助100%乙醇溶剂提取法提取效率显著高于其它提取方式(p<0.05);在GC-MS检测条件下,色谱峰分离度良好,样品2-AP保留指数在参考保留时间范围内,且与标准品质谱信息相似度达90.4%;UPLC定量方法学考察结果表明,在30~500μg/m L质量浓度范围内2-AP线性关系良好(r2=0.999 5),方法检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为0.005 14 mg/mL和0.017 1 mg/mL,样品加标回收率在92.6%~98.6%之间,相对标准偏差(δRSD)在0.95%~3.23%之间。该方法全面、准确、灵敏度高,适用于香露兜等植物中2-AP的准确鉴定和定量分析。

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。

香禾糯酿酒原料的理化性质及挥发性化合物分析

为促进贵州省黔东南少数民族特色香禾糯的开发利用,检测其基本理化指标、功能活性成分及总抗氧化能力,并与普通糯米进行对比。结果表明:6种香禾糯和2种普通糯米中均含有较高的淀粉含量,适当的脂肪、水分、蛋白质、氨基酸、矿物元素含量及配比,以及一定量的功能活性成分黄酮与多酚。共检测出45种挥发性成分,并在雷佳禾(LJ)、红禾(H)、腊水禾(LS)3种香禾糯中检测出香米呈香的最重要化合物2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)。通过扫描电子显微镜检测,表明6种香禾糯和2种普通糯米淀粉粒径、形状基本相似。主成分分析得出H综合得分最高,且含有多种营养物质,可以作为较理想的酿造原料。相比于其他糯米,H含有多种呈香呈味成分及适当营养成分,对酿造成品的一类香气(原料香)和营养价值贡献潜力更大,更加有益于形成发酵产品的优良风味和提升产品的营养价值,从而提高香禾糯的开发利用价值。

中华枸杞中1个新的香豆素葡萄糖苷

目的研究中华枸杞Lycium chinense果实的化学成分。方法采用硅胶、D101大孔吸附树脂、ODS等柱色谱以及半制备液相色谱等现代分离技术进行分离纯化,根据化合物的波谱数据和理化性质进行结构鉴定,并对部分化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果从中华枸杞醋酸乙酯部位分离得到11个化合物,分别鉴定为7-O-(6-O-3-羟基异丁酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-6-甲氧基香豆素(1)、东莨菪苷(2)、东莨菪素(3)、反式对香豆酰基-β-D-葡萄糖苷(4)、cassoside I(5)、对羟基苯乙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、苯甲醇吡喃葡萄糖苷(7)、苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(9)、5-O-对香豆酰奎尼酸甲酯(10)、绿原酸甲酯(11)。结论化合物1为1个新的香豆素葡萄糖苷,命名为枸杞苷E。化合物10和11为首次从该属植物中分离得到。化合物4~11为首次从该植物中分离得到。化合物11对α-葡萄糖苷酶具有弱的抑制作用。