绵羊ApoER2基因克隆及其干扰质粒对睾丸共培养细胞硒蛋白表达的影响

本研究旨在克隆绵羊ApoER2基因,构建ApoER2-siRNA质粒载体,研究ApoER2基因沉默对睾丸共培养细胞SelP和PHGPx表达的影响。利用RT-PCR技术,克隆ApoER2序列,在此基础上构建4种pGPU6/GFP/Neo—ApoER2-siRNA质粒表达载体,利用脂质体将其转染到体外共培养绵羊睾丸细胞中,采用Real—time PCR和Western blotting方法,检测其抑制效应,并研究ApoER2基因沉默对Sel P和PHGPx mRNA表达的影响。本研究成功获得了长度为2 490 bp的绵羊睾丸ApoER2完整编码区序列,共编码892个氨基酸,绵羊ApoER2核苷酸序列与牛的同源性最高,相似性为97.7%。ApoER2-siRNA-1565和ApoER2-siRNA-2567位点重组质粒的干扰效果较好(P<0.01),选取ApoER2-siRNA-2567重组质粒,结果显示转染组Sel P和PHGPx表达量显著降低(P<0.01)。获得了绵羊ApoER2编码区序列和有效抑制该基因表达的2个质粒载体,ApoER2沉默可能影响了睾丸硒蛋白Sel P和PHGPx的表达,为进一步研究ApoER2转运硒机理提供了理论依据。

阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。

KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。

小麦TaWASI2基因克隆和表达

为了探讨小麦中wasi基因的结构与功能,以大麦basi基因的EST为基础,通过电子克隆结合RT-PCR方法分离克隆获得了608 bp的小麦α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因TaWASI2。序列分析显示,所克隆的基因片段包含513 bp的开放阅读框,编码一个含有170个氨基酸的多肽,具有保守的STI结构域。通过半定量PCR对TaWASI2基因的表达特性分析表明:TaWASI2基因在种子发育过程中表达量逐渐增加;在胚乳中表达高于其他组织。

抗C-erbB-2单克隆抗体在荷人乳腺癌裸鼠体内的预定位显像

目的以153Sm标记的抗C-erbB-2单克隆抗体对荷人乳腺癌移植瘤裸鼠进行肿瘤预定位显像的研究。为乳腺癌早期诊断提供一种新方法,并为其临床应用提供实验依据。方法实验I组每只裸鼠采用三步预定位法从尾静脉注射7.4 MBq/0.1 ml的153Sm-DTPA-C-erbB-2 McAb实验II组与II组分别直接从尾静脉注射7.4 MBq/0.1 ml的135 Sm-C-erbB-2及135Sm-IgG并于于注射后2、4、8、24h行全身SPECT显像。于4、82、4 h分批处死裸鼠并测定分别在肿瘤、血液、心脏、肺等重要脏器单位重量的放射性比值(%ID/g)。结果在运用预定位技术加药的实验I组在给药后2小时开始有抗体在肿瘤组织浓聚,在8小时时达到最高,与实验II组直接给予抗体比较,血液本底低,两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论应用预定位技术的实验组,瘤/血液比值高,血液本底低,周围正常组织吸收剂量低,显像效果好。

苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象(BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸);NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因(BnGS2-1或BnGS2-2)均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。

IL-2R单克隆抗体诱导疗法对移植肾功能延迟恢复的影响

目的探讨IL-2R单克隆抗体诱导疗法对移植肾功能延迟恢复(DGF)的影响。方法回顾分析183例2004年1月-2006年1月在移植中心行首次同种异体尸肾移植病例,根据是否应用IL-2R单抗诱导疗法,将其分为诱导组79例和对照组104例,分析比较两组患者的DGF发生率,以及两组DGF患者的治疗和随访情况。结果诱导组和对照组间的DGF发生率无显著性差异(17.7%vs23.1%,P>0.05)。但诱导组DGF患者并发急性排斥反应(AR)的发生率明显低于对照组DGF患者(0%vs25%,P<0.05),且诱导组DGF患者的1年移植肾存活率高于对照组DGF患者(92.9%vs62.5%,P<0.05)。结论IL-2R单抗诱导疗法对DGF的预防作用不显著,但可以有效降低DGF期间发生AR的风险,改善DGF患者的移植肾存活情况。

大鼠抗小鼠重组Foxc2单克隆抗体的制备与检测应用

目的 :为了研究叉头框c2 (Foxc2 )在骨骼和主动脉发育上的作用。方法 :利用基因重组融合蛋白制作大鼠抗小鼠Foxc2单克隆抗体 (抗 Foxc2mAb) ,并利用蛋白质印迹和免疫荧光分析了Foxc2蛋白在小鼠肌胚细胞C2C12的表达和在小鼠胚胎的表达部位。结果 :用小鼠GST Foxc2融合蛋白免疫大鼠制得的抗 Foxc2mAb效价为 1∶5 0 0 0 ,并特异地与转染了CX Foxc2质粒的小鼠L细胞和人膀胱癌HTB9细胞产生的Foxc2蛋白结合。在骨成形蛋白 2 (BMP 2 )的诱导下 ,Foxc2蛋白在C2C12细胞中显著地增加 ,用反义Foxc2序列转染C2C12细胞可以明显地抑制Foxc2蛋白在这个细胞系中的表达。Foxc2蛋白表达主要定位于 11 5 dpc小鼠胚胎的生骨节和主动脉周围的间充质组织。结论 :应用大鼠抗小鼠基因重组Foxc2单克隆抗体研究Foxc2的作用 ,结果表明Foxc2蛋白在BMP 2的诱导下 。

抗IL-2R单克隆抗体在肾移植高危患者中应用效果的临床观察

目的探讨抗白介素-2受体(IL-2R)单克隆抗体舒莱和塞尼哌在肾移植高危患者中应用的疗效及安全性。方法69例肾移植高危患者被随机分为抗IL-2R单克隆抗体治疗组(39例)和非治疗组(30例),前者在三联免疫抑制剂基础上加用抗IL-2R单克隆抗体舒莱(术前2h及术后第4天各20mg静滴)或赛尼哌(术前24h及术后第14天各50mg静滴)治疗,后者未给与抗IL-2R单克隆抗体。观察移植术后1年排斥反应发生率、人/肾存活率及不良反应事件发生率。结果术后1年,抗IL-2R单克隆抗体治疗组和非治疗组排斥发生率分别为5.13%和16.67%,差异有统计学意义。两组比较,1年人/肾存活率及不良反应事件发生率差异均无显著性。结论在肾移植高危患者中应用抗IL-2R单克隆抗体(塞尼哌、舒莱)可明显减少患者移植术后急性排斥反应发生率,但在提高患者人/肾1年存活率及减少不良反应发生率方面未见明显疗效。

抗C-erbB-2单克隆抗体在荷人胃癌裸鼠体内的预定位显像

目的以153Sm标记的抗C-erbB-2单克隆抗体对荷人胃癌移植瘤裸鼠进行肿瘤预定位显像的研究。为胃癌早期诊断提供一种新方法,并为其临床应用提供实验依据。方法实验Ⅰ组每只裸鼠预定位法从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml实验Ⅱ组与Ⅲ组分别直接从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml的135Sm-C-erbB-2及135Sm-IgG并于于注射后2、4、8、24h行全身SPECT显像。于4、8、24h分批处死裸鼠并测定分别在肿瘤、血液、心脏、肺等重要脏器单位重量的放射性比值(%ID/g)。结果在运用预定位技术加药的实验I组在给药后2h开始有抗体在肿瘤组织浓聚,在8h时达到最高,与实验Ⅱ组直接给予抗体比较,血液本底低,两组比较差异有显著性。(P<0.05)。结论应用预定位技术的实验组,瘤/血液比值高,血液本底低,周围正常组织吸收剂量低,显像效果好。

猪圆环病毒2型去除NLS的cap蛋白基因的克隆与B细胞抗原表位的预测

本试验克隆了猪圆环病毒2型去除核定位信号的ORF2基因,并对其B细胞抗原表位进行预测。根据新分离毒株PCV2-871[1]的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去掉核定位信号的ORF2基因,命名为pcv-581,利用引入的双酶切位点BamHⅠ/HindⅢ将其连接到表达载体pQE-32中,命名为pQE-pcv581转化大肠杆菌M15中,同时采用DNAStar软件对去除NLS的ORF2基因进行B细胞抗原表位的预测,为单克隆抗体的制备和抗原表位的鉴定奠定基础。

抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达及其产物分析

目的:研究抗人表皮生长因子受体2(HER2)人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法:合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果:表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论:实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文)

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子.

野桑蚕serpin2基因的克隆及转录表达分析

以野桑蚕Bombyx mandarina 5龄第3天幼虫为实验材料,利用RT-PCR技术,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina serpin2cDNA,并对其转录表达模式进行了分析.结果表明:野桑蚕Bombyx mandarina serpin2基因的完整开放阅读框长1 125bp,有7个内含子,8个外显子,编码374个氨基酸,蛋白质的分子质量为41 760,pI为4.87.氨基酸序列具有与其他昆虫serpin2的共有特征.该基因的mRNA在表皮和马氏管中的表达水平较低,而在脂肪体中的表达水平最高.

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.

^(131)I标记抗肺癌单克隆抗体1E2在荷瘤小鼠体内分布及对小鼠移植瘤作用

目的:分析碘-131(131I)标记抗肺癌单克隆抗体1E2在荷Lewis肺癌小鼠体内分布,评估瘤内注射碘-131标记抗肺癌单克隆抗体1E2(131I-1E2)对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用。方法:C57BL/6小鼠右后腿皮下接种Lewis肺癌细胞(LLC)1×106/只,建立荷Lewis肺癌小鼠模型,免疫组化检测Lewis肺癌细胞(LLC)膜上1E2抗原-氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)的表达。131I标记1E2单抗(氯胺T法),检测标记率、放化纯度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾静脉注射标记抗体131I-1E218.5MBq,观察其不同时间点在小鼠体内的分布。成瘤后小鼠随机分为4组,分别瘤内注射生理盐水0.1ml(空白对照),1E2单抗3μg(阳性对照),131I-IGg18.5MBq(阴性对照),131I-1E218.5MBq。治疗后每周2次测定肿瘤大小,21天后处死小鼠观察肿瘤组织病理学改变,检测肿瘤体积、重量,计算抑瘤率。结果:1E2抗原-CPS1主要在肿瘤细胞膜表达,131I-1E2标记率为67.73%,放化纯度为95.63%。131I-1E2主要分布在肿瘤组织,治疗后3周试验组肿瘤体积为(0.75±0.15)cm3,重量为(1.60±0.19)g,抑瘤率78.30%,与对照组间比较差异有统计学意义(P<0.01),对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组与对照组间病理学差异显著。结论:131I-1E2瘤内注射可抑制肿瘤的生长,具有潜在的临床应用价值,有可能成为新的肿瘤治疗靶向药物。

Annexin A2单克隆抗体抗肿瘤活性的实验研究

目的研究人膜联蛋白A2(Annexin A2)单克隆抗体的抗肿瘤活性,探讨Annexin A2在肿瘤发生发展中的作用。方法表达纯化Annexin A2重组蛋白,免疫小鼠及细胞融合制备单克隆抗体,用间接ELISA检测抗体的效价,Western blot和免疫共沉淀检测抗体的特异性。MTT法检测外源性Annexin A2抗体对肿瘤细胞生长的影响,流式细胞术检测其对肿瘤细胞周期的影响,RT-PCR及Quantitative real-time PCR检测对肿瘤细胞周期相关基因的影响,transwell检测其对HepG2细胞的侵袭及迁移的影响。结果 Annexin A2重组蛋白免疫小鼠,获得效价高的单克隆抗体。MTT结果显示,与对照细胞相比,外源抗体能够抑制HepG2细胞的生长。细胞周期相关检测结果显示,Annexin A2蛋白的表达与肿瘤细胞的生长周期相关基因具有相关性。transwell结果显示,外源抗体的处理抑制HepG2细胞的迁移,但促进了HepG2细胞的侵袭。结论 Annexin A2重组蛋白免疫Balb/c小鼠后,获得高滴度特异性的单克隆抗体。获得的Annexin A2单克隆抗体具有抑制生长迁移作用,为肿瘤的诊断及治疗提供了实验依据。

CCN2单克隆抗体对硬膜外瘢痕粘连治疗作用的动物研究

目的探讨CCN2单克隆抗体对硬膜外瘢痕粘连的治疗作用及潜在机制。方法制备椎板切除模型大鼠,以CCN2单抗处理模型大鼠,观察其对大鼠硬膜外瘢痕粘连以及细胞外基质表达的影响。以TGF-β1处理原代成纤维细胞,观察CCN2单抗处理对模型细胞增殖活性、细胞外基质表达以及炎性因子分泌等的影响,检测CCN2单抗对模型细胞中TGF-β/Smads信号通路的影响。结果 CCN2单抗处理能明显改善模型大鼠硬膜外瘢痕粘连情况,降低瘢痕组织及模型细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA的表达水平(P<0.05)。同时,CCN2单抗还能抑制模型细胞的增殖活性,以及成纤维细胞生长因子FGF-2与IL-6的表达量,并能降低模型细胞中TGF-β2、TGF-β3的表达水平及p-Smad2的含量,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CCN2单抗处理可抑制成纤维细胞内TGF-β/Smads信号通路的活化,进而抑制成纤维细胞的过度增殖及炎性反应的发生,缓解硬膜外粘连症状。

口蹄疫病毒YN株VPl-2A基因的克隆及遗传变异分析

以口蹄疫病毒YN株RNA为模板，用设计的特异引物RT—PCR扩增出大小为1055bp的基因片段，并对PCR产物克隆测序进行序列分析。结果表明：供试病毒的VP1-2A基因的核苷酸序列与参考毒株的同源性为77．65％-93．00％，对应的氨基酸序列同源性为87％-97％。