2型鹅星状病毒VP27蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为进一步研究2型鹅星状病毒(GAstV-2)及其纤突结构蛋白VP27,通过基因密码子优化合成构建pCZN1-VP27原核表达质粒;利用大肠杆菌系统通过IPTG诱导表达VP27蛋白后进行纯化,以纯化的VP27蛋白免疫新西兰白兔,收获抗血清并纯化得到VP27多克隆抗体;分别通过间接ELISA和SDS-PAGE分析抗体的效价和纯度;将GAstV-1、GAstV-2病毒液接种LMH细胞,通过免疫印迹和免疫荧光试验对VP27多克隆抗体进行验证;将GAstV-2阳性或阴性的临床病料组织研磨液接种LMH细胞,利用VP27多克隆抗体进行免疫荧光检测以评价其临床应用效果。结果显示:纯化后的VP27多克隆抗体效价高达1∶3280500,纯度高于85%。免疫印迹试验结果显示,GAstV-2感染组在35ku处出现特异性条带,GAstV-1感染组则未出现该条带;免疫荧光结果显示仅GAstV-2感染组可观察到特异性荧光;临床病料组织的免疫荧光试验结果显示,GAstV-2阳性的病料组织均可出现特异性荧光,GAstV-2阴性的病料组织未出现荧光。研究获得了可特异性识别GAstV-2的VP27多克隆抗体,为深入研究VP27蛋白在GAstV-2的感染和致病机制中的作用提供生物材料,也为建立GAstV-2抗原免疫检测技术奠定基础。

基因2型鹅星状病毒EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR的建立与应用

目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料荧光定量一步法RT-PCR检测方法。结果:所建立方法采用dUTP/UDG酶防污染体系,其标准曲线在2.58×10^(1)~2.58×10^(7) copies/μL质粒模板量呈现良好的线性关系,斜率为-3.413,相关系数(R^(2))为0.995,熔解温度T_(M)为(85.5±0.5)℃;该方法对质粒标准品检测灵敏度下限为25.8 copies/μL;该方法特异性检测GoAstV-2,而新城疫病毒(NDV)、H5型禽流感病毒(AIV-H5)、禽呼肠孤病毒(ARV)等11种常见禽传染病病原检测结果均为阴性。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于2%,表明其具有良好的重复性。GoAstV-2感染病死鹅组织定量检测显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、小肠、大脑和肌肉组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏病毒含量最高(2.58×10^(11) copies/g),大脑和肌肉组织含毒量较低。32份临床送检病死鹅组织样品的检测显示,9份存在GoAstV-2感染,阳性率为28.1%。结论:EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR能高效检测GoAstV-2,可应用于禽类GoAstV-2感染的诊断和净化检测。