2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐的急性毒性和致突变作用研究

目的：研究2-（a-羟基戊基）苯甲酸钾盐（dl—PHPB）的急性毒性及致突变性。方法：急性毒性试验采用Bliss法，昆明小鼠分为5组，每组10只，雌雄各半，分别按256．0、286．3、320．0、357．8、400．0、447．2mg／kg静脉注射dl—PHPB，观察注射后至给药后14d动物的毒性反应性质及程度，计算半数致死剂量（LD50）及95％可信限；Ames试验采用平板掺入预培养法，选用鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100和TA102，每皿10．5～5000．0μg浓度范围内，检测加和不加S9条件下对Ames菌的致突变性；微核试验采用雄性昆明小鼠，分为3组，每组6只，分别按23．3、70、210mg／kg单次静脉注射dl—PHPB，注射后24h计数骨髓嗜多染红细胞微核率（MNPCEs）；体外染色体畸变试验在加和不加S9条件下，检测11．0～88．0μg／mL dl—PHPB对CHL细胞染色体畸变率的影响。结果：小鼠静脉注射dl—PHPB后，各剂量动物出现--过性呼吸急促、自发活动减少、俯卧少动等症状，随剂量增加至≥320．0mg／kg时，部分动物出现濒死症状，并在给药后2～30min内死亡，死亡率随剂量的增加而增加，256．0～447．2mg／kg6个剂量组死亡率依次为0、0、10％、30％、70％、100％。未死亡动物在给药30min后逐渐恢复正常。14d观察期期间动物未见其他异常。其LD50为373．3mg／kg，95％可信限为355．6～392．0mg／kg；Ames试验结果显示，在每皿0．5—5000．0μg浓度范围内未引起4种测试菌株回复突变数增加；微核试验结果显示，dl—PHPB在23．3～210．0mg／kg范围内，各组动物MNPCEs均低于4‰；CHL细胞体外染色体畸变试验中，dl—PHPB在11．0～88．0μg／mL浓度范围内致CHL细胞染色体畸变率〈5％。结论：在本实验条件下，小鼠静脉注射dl—PHPB的LD50为373．3mg／kg，致突变性3项试验均为阴性结果。

2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐（PHPB）对APP/PS1转基因小鼠海马神经元、突触和轴突损伤的保护作用

目的利用10月龄APP/PS1转基因小鼠考察2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐(PHPB)对海马神经元、突触及轴突损伤的保护作用。方法 10月龄APP/PS1转基因小鼠及同龄野生型对照小鼠被随机分为3组:野生对照组(n=10),APP/PS1转基因组(n=10),PHPB治疗组(n=10)。PHPB治疗组每天灌胃给予30 mg·kg-1PHPB,其余两组给予相同体积的生理盐水。连续给药3个月后,进行活体1H-MRS检测,之后取海马组织进行电镜观察,高尔基染色,免疫组化染色及Western蛋白印迹实验检测,考察病理改变及药物的改善作用。结果电镜结果显示,野生对照组小鼠海马CA1及CA3区神经元饱满,双层核膜清晰完整,核内染色质分布均匀。核周线粒体丰富,高尔基体和核糖体等细胞器形态基本正常。APP/PS1小鼠海马神经元呈现细胞皱缩,染色质聚集,线粒体肿胀,脊断裂,高尔基体变性扩张等病理改变,此外在轴突可见大量聚集的未成熟自噬囊泡。经PHPB给药后,上述病理改变均呈现不同程度的改善。此外,相比于野生对照组小鼠,APP/PS1小鼠CA1及CA3区的突触密度明显降低(P<0.01),突触后致密区厚度明显变薄(P<0.05),经PHPB给药后,该区域突触密度及PSD厚度显著提升(P<0.05)。高尔基染色结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠CA1区及DG区海马神经元二级和三级树突分枝上的树突棘密度明显降低(P<0.01),经PHPB治疗后可见明显提升(CA1:P=0.070;DG:P<0.05)。Sholl分析显示相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1转基因小鼠海马DG区神经元分枝数目明显降低(P<0.05),PHPB治疗能够明显提升其树突分枝数量(P<0.05)。Western蛋白印迹实验结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马组织中PSD-95,SYP等突触相关蛋白的含量明显降低(P<0.01),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显提升,而PHPB能够显著提升APP/PS1转基因小鼠海马组织中PSD-95的含量(P<0.05),并下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.01),提示其对突触丢失及自噬异常的改善作用。免疫组化结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马区LC3-Ⅱ阳性染色面积显著增加,而经PHPB治疗后,阳性区域面积呈降低趋势(P=0.055),提示PHPB可以对LC3-Ⅱ阳性自噬囊泡聚集造成的轴突变性起到一定缓解作用。在体1H-MRS结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马NAA及Glu等代谢物含量明显降低(P<0.05),而经PHPB治疗后2种代谢物含量均呈上调趋势(NAA:P=0.077;Glu:P=0.066)。由于NAA主要存在于成熟神经元及轴突,而Glu作为兴奋性神经元的神经递质主要储存于突触,该结果进一步表明APP/PS1转基因小鼠海马的退行性病变,及PHPB对该区域神经元和突触的改善作用。结论 PHPB能够明显改善APP/PS1转基因小鼠海马神经元及细胞器微观结构,提升突触数量,PSD厚度,增加树突棘密度,上调突触相关蛋白含量,改善海马神经元自噬障碍及代谢异常,表现出对海马神经元、突触及轴突损伤的保护作用。

2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾冻干粉注射液的血管及肌肉刺激、溶血、过敏试验研究

目的观察Ⅰ类抗脑缺血候选药物2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾(dl-PHPB)冻干粉注射液的血管、肌肉刺激性和是否具有溶血、凝聚及过敏作用。方法Beagle犬静脉滴注dl-PHPB 1.2,3.6,10.8 g/L及氯化钠注射液对照组,给药30 d,每天1次,停药后观察3周;家兔耳缘静脉及股四头肌注射dl-PHPB 1 mg/kg和2 mg/kg,给药7 d,每天1次,停药后观察2周;进行病理检查。不同浓度的dl-PHPB在5 mL兔红细胞氯化钠注射液中放置4 h,观察溶血及凝聚作用。豚鼠静脉注射dl-PHPB 3,30 mg/k g,隔日1次,共5次,末次致敏后14 d激发1次,激发剂量为致敏剂量的3倍,观察其过敏反应。结果dl-PHPB冻干粉注射液在兔及beagle犬的血管内皮及兔肌肉组织未见明显的损伤和刺激作用;对兔红细胞没有致溶血和凝聚作用,豚鼠未出现过敏反应。结论dl-PHPB冻干粉注射液对用药血管、肌肉无刺激性反应,无红细胞溶血、凝聚现象及过敏反应。上述研究结果为dl-PHPB的临床安全合理应用提供了参考。

2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾反复给药对大鼠的毒性研究

目的观察Ⅰ类抗脑缺血新药2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾[potassium 2-(1-hydroxypentyl)-benzoate,dl-PHPB]反复给药对大鼠的毒性反应。方法SD大鼠,雌、雄各半,根据给药剂量分为10,30,90 mg/kg组及溶剂对照组,尾静脉反复给药30 d,停药后恢复期观察21 d。检测指标包括动物一般状况、体重、进食量、血液常规、血液生化、尿10项和病理组织学检查等。结果 SD大鼠连续静脉注射dl-PHPB 30 d,可剂量依赖性地引起肝脏重轻度增加、血清球蛋白升高、凝血酶时间(TT)延长。30,90 mg/kg剂量组尿潜血阳性及90 mg/kg剂量组尿蛋白升高。这些改变停药后均可恢复。在90 mg/kg剂量、药物质量浓度为45 g/L时,可见明显的血管刺激性,恢复期结束时血管病变仍然存在,但已开始修复。结论SD大鼠静脉注射dl-PHPB 30 d,其无毒反应剂量为30 mg/kg(相当于药效剂量的10倍);90 mg/kg(相当于药效剂量的30倍)时可见轻度毒性反应,主要为可逆性的肝脏、肾脏损伤及血管刺激性。上述研究结果为dl-PHPB的临床安全合理应用提供了参考。

2-(α-羟基戊基)苯甲酸盐对痴呆大鼠大脑皮质、海马微细结构的影响

目的探讨2-(α-羟基戊基)苯甲酸盐(HPB)对痴呆大鼠大脑皮质、海马微细结构的影响。方法 SD健康大鼠72只,其中60只被联合采用D-半乳糖、亚硝酸钠及三氯化铝复制为大鼠痴呆模型,并随机分为模型组、多奈哌齐组、HPB 15 mg/kg组、HPB 45 mg/kg组、HPB 135 mg/kg组,每组12只;另12只正常大鼠作为对照组。3个HPB组分别给予相应剂量的HPB灌胃给药,每天1次,连续30 d,第30天处死动物、取材。采用水迷宫测试各组大鼠的行为学,ELISA法检测脑组织sAPPα、Aβ42含量,HE染色和改良Bielschowsky氨银液染色观察大鼠大脑皮质、海马微细结构的变化。结果与对照组比较,模型组平均潜伏期(IP)、第一次穿越原平台位置的时间(FTAPT)明显延长,在原平台象限活动的时间(TAOP)明显缩短;与模型组比较,HPB 45 mg/kg组、HPB 135 mg/kg组、多奈哌齐组大鼠的IP、FTAPT缩短,TAOP延长,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,模型组大鼠的脑组织sAPPα含量降低、Aβ42含量升高;与模型组比较,HPB 45 mg/kg组、HPB 135 mg/kg组、多奈哌齐组大鼠的脑组织sAPPα含量升高,但Aβ42含量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);HE染色结果显示,模型组大鼠海马CA3区神经元排列不整齐、数量少,细胞小、结构模糊、核固缩;HPB 135 mg/kg组大鼠海马CA3区神经元排列较整齐、数量增多,结构较清晰;改良Bielschowsky氨银液染色结果显示,模型组皮质神经元体积小、数量少,排列分散、层次不清,皮质神经元之间、皮质与海马之间神经纤维细而稀疏;HPB 135 mg/kg组大鼠脑皮质神经元体积明显变大、数量明显增多,排列较整齐,皮质与海马之间神经纤维较多。结论 HPB对痴呆大鼠大脑皮质、海马微细结构有一定的改善作用,从而提高其空间学习记忆能力;其机制可能与HPB提高痴呆鼠脑组织sAPPα表达、降低Aβ42表达有关。

2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐对大鼠血小板聚集、PGI_2/TXA_2比值和纤溶系统活性的影响

目的观察2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐对大鼠血小板聚集及前列环素/血栓素A2和纤溶系统的影响。方法大鼠随机分为正常对照组、2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐(1.3、3.9、12.9 mg·kg-1)给药组和噻氯匹定组。2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐静脉给药30 min后,腹主动脉取血,血小板聚集仪检测血小板聚集率,流式细胞术测定血小板表面CD62p的表达,放免法检测大鼠血浆血栓素B2和6-酮-前列腺素F1α含量,酶联免疫分析法检测组织型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活物抑制物1的含量。结果 2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐在对抗二磷酸腺苷、胶原、花生四烯酸和凝血酶4种诱导剂引起的血小板聚集中,可显著的、剂量依赖性的抑制二磷酸腺苷诱导的大鼠血小板聚集,降低血小板表面CD62p的表达,增加大鼠血浆前列环素代谢物6-酮-前列腺素F1α含量,对血栓素A2代谢物血栓素B2无影响,2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐还明显减少纤溶酶原激活物抑制物1含量,不影响血浆中组织型纤溶酶原激活剂的含量。结论 2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐可明显抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集和活化,升高前列环素/血栓素A2比值,增强纤溶系统活性。

前药dl-PHPB的急性毒性及伴随毒代动力学研究

目的评价Beagle犬静脉注射丁基苯酞(dl-NBP)前体2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾(dl-PHPB)的急性毒性反应及伴随毒代动力学。方法采用近似致死剂量法(ALD),给药剂量分别为41 mg/kg9、3 mg/kg2、10 mg/kg3、15 mg/kg。同时采用HPLC-UV方法测定血药浓度,使用DAS软件进行数据处理,和毒代动力评价,采血时间为给药后3 min1、5 min3、0 min1、h2、h4、h、6 h和8 h。结果随给药剂量的增加逐渐出现身体颤抖、头部震颤、呕吐、站立不能、后肢肌束震颤等反应,但给药后2 h基本恢复正常;315 mg/kg剂量组动物给药后6 min死亡。dl-PHPB可快速转化为dl-NBP,其AUC0-∞分别为24.8μg hr/mL、49.0μg hr/mL、76.0μg hr/mL,明显低于dl-NBP的AUC0-∞分别为200.8μg hr/mL、340.6μg hr/mL、407.1μg hr/mL。结论 Beagle犬单次静脉注射dl-PHPB的近似致死剂量范围为210 mg/kg^315 mg/kg。伴随毒代动力学研究显示dl-PHPB的毒性反应与其快速转化为dl-NBP密切相关。

前药dl-PHPB在Beagle犬中反复给药毒性及伴随毒代动力学研究

目的评价I类抗脑缺血新药2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾(dl-PHPB)在Beagle犬中反复给药30d的毒性及伴随毒代动力学。方法 Beagle犬反复给药30d,给药剂量分别为6、18、54mg/kg(分别相当于临床人体用量的3.6、10.8和32.4倍)并设溶剂对照组,停药后恢复期观察3周。同时采用HPLC-UV方法测定不同剂量下首次和末次给药的血清药物浓度。结果 54mg/kg剂量组的主要毒性反应为部分动物给药过程中出现头部颤抖,给药结束时可见血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿pH值有所增加,相关脏器病理组织学检查未见异常;恢复期结束时上述指标均恢复正常。在6、18、54mg/kg剂量下,药后1h内dl-PHPB即完全转化为丁基苯酞(dl-NBP)。首次给药后,其活性代谢物dl-NBP的AUC0-∞分别为2.8、7.2、32.5μg.h-1.ml-1,末次给药dl-NBP的AUC0-∞分别为2.9、8.1、38.7μg.h-1.ml-1。其转化为dl-NBP的暴露比(AUC30th/AUC1st)分别为1.02、1.12和1.17。结论 Beagle犬静脉滴注dl-PHPB30d连续给药非毒性反应剂量为18mg/kg。伴随毒代动力学研究显示dl-PHPB的毒性反应与其快速转化为dl-NBP密切相关。