伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderiasp.JT1 5 0 0的一段DNA片段 (4 8kb)亚克隆到表达载体pUC1 8上 ,得到重组子pEK1 2 3。测序后的pEK1 2 3重组子 4 8kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库 ,序列接受号为AJ5 663 3 3。对这一DNA片段的序列分析显示 ,此DNA片段含有 3个阅读框 ,且在这 3个阅读框 5′端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3 ,其阅读框长度为 1 1 5 8bp ,编码 3 86个氨基酸 ,与已报道的RalstoniaeutrophaHF3 9羟化酶 (单加氧酶 ,bec)氨基酸序列有 64%的同源性。pEK1 2 3对 2 萘酸代谢途径中 4个关键底物的转化实验结果显示 ,其基因产物仅对 2 萘酸发生加氧转化反应 ,而且 2 萘酸浓度有明显的降低 ,证实此基因是 2 萘酸单加氧酶基因 (nmo)。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中SDS PAGE结果表明 ,pXK3、pEK1 2 3两重组子中 2 萘酸单加氧酶表达量并没明显区别 ,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后 ,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物 ,对单加氧酶活有促进作用。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007吲哚-3-乙酰胺IAA合成功能及其依赖途径鉴定

【目的】探索吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)合成生长素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力,并阐明B.pyrrocinia JK-SH007存在色氨酸依赖型的吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide, IAM)IAA合成途径。【方法】使用Salkowski比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行L-色氨酸对B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA能力影响的检测;以B.pyrrocinia JK-SH007全基因组为模板,设计特异性引物克隆iaaM和iaaH基因,并使用生物信息学方法对其蛋白质和亲缘关系进行分析;通过实时荧光定量PCR方法分析B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因在L-色氨酸处理下的差异表达。【结果】B.pyrrocinia JK-SH007菌株能够合成15.663μg·mL-1的IAA,在以L-色氨酸为前体的条件下其合成IAA的量显著增加,达到了44.404μg·mL-1。iaaM和iaaH基因均含有一个完整的开放阅读框,其中iaaM基因全长1 782 bp,编码593个氨基酸,属于Aminooxidase super family家族;iaaH基因全长1 368 bp,编码455个氨基酸,属于Amidase super family家族。在L-色氨酸的处理下,B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因的表达量均显著增加。【结论】B.pyrrocinia JK-SH007具有合成IAA的能力,L-色氨酸对其合成IAA具有显著促进作用,且克隆得到了iaaM和iaaH基因,其在进化上具有一定的保守性,证明B.pyrrocinia JK-SH007中存在吲哚-3-乙酰胺IAA合成途径。

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。