人源M2二联体靶抗原BO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的:表达二联体BO-E2重组融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT- PCR)方法扩增得到抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的二个靶抗原侧链:二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC-E2)、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-BCOADC-E2,pET28a(+)-OGDC-E2,pET28a(+)-BO-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、westem blot等鉴定.结果:经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了3种重组质粒.异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,获得3种融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性.结论:重组表达的BO-E2融合蛋白将有利于PBC的实验室诊断.

胃泌素受体拮抗剂丙谷胺和选择性COX2抑制剂塞来昔布对人胃癌细胞株BGC-823增殖和PGE2分泌的影响

目的:探讨胃泌素受体拮抗剂丙谷胺和选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布对人胃癌细胞株BGC-823增殖的抑制作用及其对COX-2、15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase,15-PGDH)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的影响.方法:采用M T T法分别检测丙谷胺和塞来昔布单独及联合应用对人胃癌细胞株BGC-823增殖的影响;RT-PCR法检测COX-2和15-PGDH m RNA的表达;Western blot检测COX-2和15-PGDH蛋白质的表达;ELISA检测细胞培养液中PGE2含量变化.结果:丙谷胺和塞来昔布呈剂量和时间依赖性地抑制胃癌BGC-823细胞的增殖.采用低于细胞增殖半数抑制浓度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)的丙谷胺(6mmol/L)和塞来昔布(50μm o l/L)联合应用,48 h时对胃癌细胞B G C-823的增殖抑制率为65.1%±7.7%,显著高于单独应用丙谷胺(6 mmol/L,38.1%±7.1%)和塞来昔布(50μmol/L,32.6%±3.3%)时的抑制率(P值均<0.05).丙谷胺和塞来昔布两药均能下调胃癌BGC-823细胞中COX-2及上调15-PGDH m RNA和蛋白的表达,联合应用比单独用药更为显著(P值分别<0.05,<0.01).同时,两药也能降低BGC-823细胞分泌PGE2,联合用药作用更加明显(P值分别<0.05,<0.01).结论:丙谷胺、塞来昔布均呈时间和剂量依赖性抑制胃癌细胞株BGC-823的增殖,其可能机制之一为通过下调COX-2 m RNA和蛋白的表达,同时上调15-PGDH mRNA和蛋白的表达,进而减少PGE2合成与分泌而实现.两药联合应用可能具有协同抗癌作用.

侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎诊断中的意义

目的探究与自身抗体抗线粒体抗体Ⅱ型(AMA-M2)发生反应的侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白(BCOADC-E2)关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断中的价值。方法克隆能够表达BCOADC-E2蛋白抗原表位同源目的基因序列BCKD, 与工程质粒pGEX-4T1进行DNA重组, 通过PCR获得15个点突变质粒, 转入原核表达菌株中进行蛋白表达与纯化;ELISA法、蛋白质印迹法鉴定其与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度并进行分析比较, 定位出对BCOADC-E2蛋白和AMA-M2特异性反应有关键影响的氨基酸, 探讨其在PBC诊断中的价值。统计学处理采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t检验。结果共获得14个突变型蛋白、1个野生型蛋白。突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A和pGEX-BCKD-C3A与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A(1.634±0.328)和pGEX-BCKD-C3A(1.744±0.345)与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-E4A(0.157±0.067)、pGEX-BCKD-V5A(0.057±0.029)、pGEX-BCKD-Q6A(0.580±0.166)、pGEX-BCKD-S7A(0.744±0.125)、pGEX-BCKD-D8A(0.351±0.135)、pGEX-BCKD-S10A(0.496±0.158)、pGEX-BCKD-V11A(0.149±0.089)、pGEX-BCKD-T12A(0.061±0.043)、pGEX-BCKD-I13A(0.007±0.017)、pGEX-BCKD-T14A(0.198±0.101)、pGEX-BCKD-S15A(0.156±0.087)、pGEX-BCKD-R16A(0.884±0.099)与AMA-M2特异性反应程度均低于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应蛋白。结论 BCOADC-E2蛋白的1号和3号位半胱氨酸是提高蛋白BCOADC-E2与PBC患者血清AMA-M2特异性反应关键性氨基酸;4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16号位氨基酸被丙氨酸代替后形成突变型蛋白会降低其与AMA-M2特异性反应程度;5号位和13号位氨基酸是影响蛋白BCOADC-E2与AMA-M2特异性反应关键性氨基酸, 对BCOADC-E2蛋白功能有着重要影响, 对BCOADC-E2关键性氨基酸进行深入研究对PBC诊治有重要意义。

原发性胆汁性肝硬化患者血清AMA-M2及其靶抗原检测的阳性率对比

目的:针对PBC患者血清同时选用国产和进口两种试剂盒检测AMA-M2及其靶抗原:丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)及抗M2-3E等免疫指标,并对其敏感性进行对比,观察两种试剂盒检测有无差异及3个指标之间的敏感性。方法:对51例PBC确诊患者的血清标本,采用上海丰翔生物公司及欧蒙公司的ELISA试剂盒对待测血清分别进行了AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2等指标的检测,进行阳性率的比较。结果:51例患者血清标本中,国产试剂盒检测AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2的阳性率分别为72.5%、90.2%、72.5%,进口试剂盒检测AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2的阳性率分别为78.4%、92.2%、82.4%,经统计软件处理得到的结果P>0.05,无明显的统计学差异。针对42例AMA阳性的患者进行AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2检测时,国产试剂盒检测的阳性率分别为85.7%、95.2%和78.6%,进口试剂盒检测的阳性率分别为95.2%、100%、95.2%,经统计软件处理后得出P>0.05,两种试剂盒检测无明显的差别。结论:使用进口和国产两种试剂盒检测AMA-M2、PDC-E2、抗M2-3E的阳性率无明显的统计学差异。AMA-M2、PDC-E2、抗M2-3E 3个指标中阳性率最高的是抗M2-3E,AMA-M2和PDC-E2差异无统计学意义。

高通量测序揭示原发性胆汁性胆管炎患者的T细胞受体图谱特征

目的揭示原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)患者T细胞受体(T cell receptor,TCR)图谱特征,并揭示大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)抗原在PBC疾病的分子模拟机制。方法采用多重聚合酶链反应和免疫组库测序技术分析PBC患者和健康对照者的CD4^(+)和CD8^(+)记忆性TCRβ链互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)序列的多样性、氨基酸组成及疏水性、共有CDR3序列。体外诱导和扩增人PDC-E2_(163-176)(人PDC-E2)抗原相关T细胞和E.coli PDC-E2_(31-44/134-147/235-248)(E.coli PDC-E2)抗原相关T细胞,通过免疫组库测序技术鉴定人(和E.coli)PDC-E2抗原相关TCRβCDR3图谱,并分析其丰度变化。结果PBC患者组和健康对照组间的CD4^(+)记忆性T细胞、CD8^(+)记忆性T细胞TCRβCDR3免疫图谱多样性相似,D50指数[CD4^(+)记忆性T细胞:0.028±0.019比0.034±0.015;CD8^(+)记忆性T细胞:(1.86±2.70)×10^(-3)比(4.62±3.89)×10^(-4)]、Shannon指数(CD4^(+)记忆性T细胞:9.473±1.346比9.734±0.933;CD8^(+)记忆性T细胞:6.197±1.519比5.436±1.629)、Gini指数(CD4^(+)记忆性T细胞:0.786±0.048比0.760±0.036;CD8^(+)记忆性T细胞:0.920±0.047比0.939±0.025)等差异均无统计学意义(P均>0.05)。PBC组和健康对照组CD4^(+)记忆性T细胞和CD8^(+)记忆性T细胞间共有CDR3序列百分比差异无统计学意义[(6.47±1.43)%比(6.21±3.18)%;t=-0.21,P=0.84]。健康对照组和PBC组中序列长度为13、14、15的CDR3分子第6位和第7位氨基酸的组成频率中部分存在显著差异,疏水氨基酸组成频率近似。通过细胞培养和免疫组库测序鉴定了一系列人PDC-E2和E.coli PDC-E2抗原刺激后丰度显著上升的TCR序列。结论该研究鉴定出PBC疾病的TCR图谱特征,从TCR这个新视角阐述了E.coli在PBC疾病中的分子模拟机制。

基于Nrf2通路探讨曲克芦丁对急性脑梗死大鼠神经功能的保护作用

目的研究曲克芦丁对急性脑梗死(ACI)大鼠神经功能保护的可能机制。方法30只大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组,每组10只。采用“线栓法”构建ACI大鼠模型,造模后干预组立即给予曲克芦丁30 mg/kg灌胃,假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃,连续给药10 d。比较各组大鼠的神经功能评分、旷场实验得分、脑组织形态结构、脑组织中氧化应激指标、凋亡蛋白及Nrf2通路关键蛋白的表达情况。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经元细胞质结构明显改变,神经元细胞明显凋亡;干预组大鼠神经元结构及存活率较模型组明显改善。与假手术组比较,模型组神经功能评分、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、乳酸脱氢酶(LDH)、Bax、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3水平显著升高,旷场实验得分、超氧化物歧化酶(SOD)、Bcl-2、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,干预组神经功能评分、MDA、iNOS、LDH、Bax、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3水平显著减低,旷场实验得分、SOD、Bcl-2、Nrf2、HO-1、NQO1水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论曲克芦丁可能通过促进Nrf2/HO-1/NQO1通路缓解大鼠ACI后的氧化损伤,抑制神经元细胞凋亡,从而保护神经功能。

前列腺素E2及其相关蛋白在难愈性创面修复中的作用研究

前列腺素(prostaglandin,PG)E具有扩张血管、舒缓平滑肌的作用,已在消化道黏膜创面修复中发挥重要作用。环氧合酶是PGE的主要合成酶,而PG转运蛋白和15-羟基PG脱氢酶是其主要的代谢蛋白。该文通过综述PGE、环氧合酶、PG转运蛋白和15-羟基PG脱氢酶在创面修复中的作用,以探讨PGE为核心的创面修复特点,为未来选择较好的促进创面修复的药物靶点提供一些思路和手段。

鹿骨粉对卵巢摘除大鼠心肌细胞HK-2和PDHc表达的影响

目的探讨鹿骨粉对卵巢摘除大鼠心肌组织中HK-2和PDHc表达和心肌结构的影响。方法对Wistar大鼠行双侧卵巢摘除术后,将大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、鹿骨粉不同剂量(SBP200、400及800 mg/kg)组。术后即刻给予鹿骨粉组大鼠相应剂量的鹿骨粉,每天1次,连续给药4个月后,处死各组大鼠,取出心脏,HE染色观察心肌结构,免疫组织化学染色检测HK-2和PDHc的蛋白表达情况。结果与Model组比较,SBP各组心肌组织中HK-2和PDHc蛋白表达均成增多趋势,心肌细胞核大小适中,染色较淡,细胞排列整齐,形态正常。结论鹿骨粉能够促进卵巢摘除后心肌细胞中HK-2和PDHc蛋白表达增高,维持心肌结构完整,对心脏具有保护作用。

低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞线粒体呼吸功能的保护作用

目的通过观察低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMVEC)低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和线粒体琥珀酸脱氢酶复合体亚基2(succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B,SDHB)表达水平以及线粒体ATP合成的影响,评价低氧预处理对氧糖剥夺HBMVEC的保护作用.方法离体培养HBMVEC,采用随机数字表法将HBMVEC分为5组(每组6孔):正常对照组(A组)、氧糖剥夺组(B组)、氧糖剥夺+低氧预处理组(C组)、氧糖剥夺+低氧预处理+二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)组(D组)和氧糖剥夺+低氧预处理+2-ME组(E组).给予低氧预处理及HIF-1α抑制剂和稳定剂后,对HBMVEC进行氧糖剥夺,使用Annexin V检测细胞凋亡和坏死;用ATP检测试剂盒测定细胞内ATP含量;采用Western blot法测定HIF-1α、SDHB蛋白表达.结果与A组比较,B组、C组、D组和E组HIF-1α表达水平明显升高,ATP含量明显减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05),B组、C组和E组SDHB表达水平明显降低(P<0.05);与B组比较,C组和D组HIF-1α和SDHB表达水平明显升高,ATP含量明显增加,细胞凋亡率明显降低(P<0.05).结论低氧预处理可通过调节HIF-1α表达改善氧糖剥夺所致的HBMVEC线粒体呼吸链复合体Ⅱ的损伤,发挥对氧糖剥夺HBMVEC模型的保护作用.