玉米6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的克隆

以玉米Ｆ１减弱表达基因的ｃＤＮＡ片段为探针，从建立的玉米ｃＤＮＡ的文库中分离到相应的ｃＤＮＡ克隆．经测序和序列同源分析证明，该ｃＤＮＡ编码６－磷酸果糖－２－激酶／果糖－２，６－二磷酸酶，其氨基酸序列与人类、大鼠、牛和鸡等动物肝脏相同基因对应区段的相似性分为为６５．７％，６３．４％，６３．７％和６１．２％．

双功能酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶4(PFKFB4)在肿瘤中的作用与研究进展

即使微环境中氧气充足,肿瘤细胞仍以较高的糖酵解率来代谢葡萄糖,这种独特的代谢方式称为有氧糖酵解(Warburg效应).这种肿瘤细胞的代谢重编程可诱导肿瘤细胞中代谢酶系和代谢方式的改变.代谢酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases,PFKFB)家族成员是果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)的最强变构激活剂,F-2,6-BP可变构激活糖酵解反应的关键酶磷酸果糖激酶-1(PFK-1),控制糖酵解通量,影响肿瘤生长.PFKFB4在多种肿瘤中过表达,是癌细胞生存和生长所必需的.本文综述了肿瘤进展中PFKFB4在糖酵解及糖酵解以外的功能,并讨论了靶向PFKFB4治疗的研究进展.

miR-384靶向PFKFB3调控小胶质细胞糖酵解及神经炎症的机制探讨

目的分析miR-384调控小胶质细胞炎症的分子机制。方法100 ng/mL LPS处理小鼠小胶质细胞(BV2)24 h,建立小胶质细胞神经炎症体外模型。miR-384 mimics与mimic NC转染BV2细胞,RT-qPCR检测6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)、己糖激酶2(HK2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达水平。miRDB数据库预测miR-384的潜在靶点,双荧光素酶报告基因实验验证miR-384与PFKFB3的靶向关系。过表达miR-384后,免疫印迹检测HK2、PFKFB3的蛋白表达水平。结果LPS诱导了BV2细胞炎症基因IL-6和IL-1β的表达,同时LPS上调了细胞上清乳酸水平。过表达miR-384抑制了LPS诱导的乳酸增加。过表达miR-384抑制了LPS诱导的糖酵解基因PFKFB3的上调;而抑制miR-384进一步增加了PFKFB3的表达。miR-384对糖酵解基因HK2无显著影响。双荧光素酶报告基因实验结果显示PFKFB3是miR-384的下游靶分子。进一步,过表达miR-384抑制了IL-1β和IL-6的表达,而抑制miR-384产生相反的结果。结论miR-384直接靶向糖酵解基因PFKFB3,能调控LPS诱导的糖酵解和神经炎症反应。

微小RNA-488靶向6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因对前列腺癌细胞增殖与糖酵解的影响

目的 探讨微小RNA（miRNA，miR）-488对前列腺癌细胞株增殖及糖酵解能力的影响及其机制。 方法 实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测miR-488在前列腺癌细胞株的表达。生物信息学、双荧光素酶实验验证miR-488的靶点，转染miR-488模拟物24 h后，以25 μg蛋白行Western blot、Real-time PCR检测6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）的表达。转染miR-488模拟物或同时转染过表达PFKFB3质粒24 h后，细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测PC-3、DU145细胞增殖，通过糖摄取及乳酸分泌实验检测糖酵解能力。结果 与正常前列腺上皮细胞RWPE-1比较，miR-488在PC-3、DU145细胞中的表达水平分别为0.26±0.03（P＝0.031）、0.19±0.04（P＝0.021），而在22RV1、LNCaP细胞中的表达差异无统计学意义。上调miR-488表达后，PC-3、DU145细胞的糖摄取率分别为对照组的0.54±0.03（P＝0.042）、0.52±0.01（P＝0.032），乳酸分泌率分别为对照组的0.55±0.02（P＝0.037）、0.61±0.17（P＝0.048），提示糖酵解能力明显下降，细胞增殖能力明显降低。生物信息学及双荧光素酶实验均表明PFKFB3是miR-488的靶点，上调miR-488表达后，PFKFB3 mRNA及蛋白表达均明显降低。同时上调miR-488与PFKFB3表达后，细胞的糖摄取分别为0.79±0.12、0.82±0.11，乳酸分泌分别为对照组的0.77±0.07（P＝0.015）、0.83±0.04（P＝0.026），提示糖酵解能力升高。此外，细胞增殖能力也明显升高。结论 miR-488可通过下调靶蛋白PFKFB3的表达，从而调控前列腺癌细胞的增殖与糖酵解。

6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因敲除小鼠模型的构建

目的建立6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）基因敲除小鼠模型。方法利用类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术，通过构建针对PFKFB3基因的TALEN质粒，并将构建好的TALEN质粒在体外反转录为mRNA。利用原核显微注射分别将0．1μl转录后的浓度为50ng／山的mRNA注射到C57BL／6品系小鼠受精卵中，将受精卵回送到ICR代孕母鼠输卵管中，得到F0代基因敲除杂合子小鼠。将FU代饲养至10周龄后合笼，从而构建基因敲除纯合子小鼠。所有子代鼠出生1周后剪尾，提取RNA后反转录，PCR产物作为模板进行基因测序鉴定基因型。结果通过TALEN技术成功构建了f1D代基因敲除杂合子小鼠3只，基因测序结果表明分别于靶基因位置缺失了10、4、1对碱基对；因PFKFB3基因敲除纯合子具有胚胎致死性，6只F1代基因敲除小鼠的基因测序结果显示，针对靶基因，编号4、5的小鼠缺失了1对碱基对，6号小鼠缺失4对碱基对，7、8、9号小鼠缺失10对碱基对。结论成功构建了PFKFB3基因敲除杂合子（＋／-）小鼠．。

6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3在胃癌中的表达和意义

目的 检测6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）在胃癌组织中的表达,分析PFKFB3对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响.方法 用实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）方法检测87例胃癌患者癌和癌旁组织中PFKFB3 mRNA表达水平,并用统计学方法分析PFKFB3 mRNA表达水平与临床病理特征的相关性.用小干扰RNA （siRNA）干扰胃癌细胞MGC803中PFKFB3的表达,并用噻唑蓝（MTT）法比较干扰后胃癌细胞增殖能力的改变,Transwell法比较干扰后胃癌细胞迁移能力的改变.结果 87例胃癌患者癌组织中PFKFB3的mRNA水平平均是癌旁组织的2.1倍.胃癌组织中PFKFB3的高表达与脉管内癌栓形成、淋巴结转移和TNM分期明显相关.siRNA干扰胃癌细胞中PFKFB3的表达后,胃癌细胞的增殖能力和迁移能力的明显下降.结论 PFKFB3在胃癌癌发生发展过程中发挥重要作用.

PFKFB3、S1P2在2型糖尿病大鼠视网膜中的表达及tBHQ的干预作用

目的研究6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3,PFKFB3)、1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine 1-phosphate receptor 2,S1P2)在2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜中的表达,并探讨叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone,t BHQ)与PFKFB3、S1P2的关系。方法雄性Sprague Dawley大鼠60只,分为正常对照组(NC组)、DM组和t BHQ组。后两组诱导2型DM模型,其中t BHQ组于造模成功后7 d在高脂高糖饲料中添加10 g·L-1t BHQ进行干预,DM组大鼠继续使用高脂高糖饲料喂养。于t BHQ干预后4周和12周各组大鼠心脏采血,检测血清空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、空腹血清胰岛素(fasting serum insulin,FINs)含量。采用免疫组织化学法及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法定量检测各组大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白及m RNA的分布和表达。采用TUNEL法检测各组大鼠视网膜神经节细胞的凋亡指数。结果三组大鼠在4周和12周的FPG、FINs总体比较差异均有统计学意义(均为P=0.000)。4周和12周时各组中均可见PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白的阳性表达,且主要分布于视网膜神经节细胞层、内核层。免疫组织化学及q RT-PCR检测结果显示,各组大鼠在造模后不同时间点视网膜中PFKFB3、S1P2、VEGF蛋白及m RNA的相对表达量的总体比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。4周和12周时,DM组PFKFB3、S1P2、VEGF的表达较NC组增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);t BHQ组PFKFB3、S1P2、VEGF的表达较DM组降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与4周比较,12周时DM组PFKFB3、S1P2、VEGF的蛋白和m RNA表达均增加(均为P<0.05),t BHQ组S1P2蛋白和m RNA的表达较4周降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。TUNEL法检测结果显示,4周和12周时DM组凋亡指数均较NC组增多,t BHQ组均较DM组减少(均为P<0.05);与4周比较,12周时DM组凋亡指数增高,t BHQ组降低(均为P<0.05)。结论PFKFB3、S1P2及VEGF共同参与2型DM大鼠视网膜的病理过程,其可能是通过PFKFB3/VEGF/S1P2信号途径起作用,并可能与视网膜神经节细胞的凋亡相关;tBHQ对2型DM大鼠视网膜有一定的保护作用。

6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因对前列腺癌细胞增殖的影响

目的观察6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）在前列腺癌组织中的表达及其对PC3和DU145前列腺癌细胞增殖的影响。方法采用免疫组织化学染色（抗体浓度1∶50）方法，观察PFKFB3基因在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR，40个循环，188 bp）、Western blot法[30 μl，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）]检测PFKFB3 mRNA和蛋白在前列腺癌细胞及前列腺上皮细胞中的表达。采用平板克隆形成实验（40 μmol/L H2O2）与细胞生长实验[20 μl噻唑蓝（MTT）]对比观察敲除PFKFB3基因前后前列腺癌细胞的生长。结果PFKFB3基因在前列腺癌组织中的表达（2.42±0.16）明显高于癌旁组织（1.38±0.10），差异有统计学意义（P＝0.031）；前列腺癌细胞中PFKFB3 mRNA和蛋白表达水平均高于前列腺上皮细胞，分别为2.0～2.6倍和2.5～4.5倍（P＝0.015）；敲除PFKFB3基因后，平板克隆形成实验结果显示细胞克隆形成率为敲除前的22%～35%（P＝0.018），细胞生长实验结果显示前列腺癌细胞的增殖在第4天受抑制，为对照组的28%～30%（P＝0.026）。结论PFKFB3基因在前列腺癌细胞和组织中高表达，PFKFB3基因对前列腺癌细胞的增殖有一定的促进作用。

PFKFB3在胶质瘤组织中的表达及其对H4细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨恶性胶质瘤组织中糖酵解限速酶6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)的表达水平及PFKFB3抑制剂PFK15对胶质瘤H4细胞增殖、迁移、克隆形成和体内成瘤的影响。方法:采集2015年2月1日至2016年1月31日安康市中医医院神经外科手术切除的31例恶性脑胶质瘤及相应瘤旁组织标本,应用免疫组化技术和Western blotting检测胶质瘤和瘤旁组织中PFKFB3的表达水平。用不同浓度的(1.25、2.5、5.0μmol/L)PFK15抑制胶质瘤H4细胞的PFKFB3表达,通过MTT法、EdU细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验分别观察PFK15对H4细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成和体内成瘤的影响。结果:PFKFB3在胶质瘤组织中阳性率显著高于瘤旁组织[(80.60±8.98)%vs(41.57±10.16)%,P<0.05]。MTT和EdU实验结果显示,PFK15可明显抑制H4的增殖活性(P<0.05),且抑制作用具有浓度依赖性。PFK15处理后的H4细胞迁移、侵袭和克隆形成能力明显低于对照组(均P<0.05)。注射PFK15的裸鼠H4细胞移植瘤体积明显小于对照组裸鼠[(254.15±154.25)vs(801.52±224.25)mm3,P<0.01]。结论:PFKFB3在恶性胶质瘤组织中高表达,下调PFKB3可显著抑制胶质瘤H4细胞的恶性生物学行为和体内成瘤,PFKFB3可作为恶性胶质瘤生物治疗潜在的分子靶点。

PFKFB3参与脂多糖诱导肺成纤维细胞及肺组织有氧糖酵解的观察性研究

目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺成纤维细胞及肺组织有氧糖酵解关键酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)表达及其与有氧糖酵解的关系,探讨在LPS诱导肺纤维化过程中肺成纤维细胞和肺组织有氧糖酵解的潜在机制。方法:将人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系采用随机数字表法分为PBS对照组(PBS组)和LPS组(每组3孔),Western blot检测LPS刺激细胞6h后PFKFB3表达情况,同时免疫荧光显示PFKFB3在细胞内的定位情况;于LPS刺激后48 h采用海马细胞能量代谢仪检测细胞耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)和产酸率(extracellular acidification rate,ECAR),并采用比色法检测有氧糖酵解产物乳酸产生情况,同时Western blot检测LPS刺激48 h后Ⅰ型胶原蛋白合成情况。将24只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为生理盐水对照组(C组)、LPS组(L组),每组12只,L组、C组连续5d分别腹腔注射5 mg/kg LPS、等容量生理盐水;每组各6只于造模后第7天无痛处死小鼠,取血浆和肺组织,Western blot和免疫荧光检测各组肺组织中PFKFB3表达情况,比色法检测各组小鼠血浆中乳酸的含量;剩余小鼠于造模后第28天取肺组织,一侧肺通过Western blot检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白合成情况,另一侧肺做石蜡切片进行病理学检测。结果:与PBS组比较,LPS刺激细胞6h后PFKFB3表达明显升高(P<0.05);LPS刺激细胞48 h后,与PBS组比较,LPS组细胞耗氧率降低、产酸率增加,代谢产物乳酸含量明显升高(P<0.05),同时细胞Ⅰ型胶原蛋白合成显著增加(P<0.05)。与C组比较,L组小鼠腹腔注射LPS 7 d后肺组织中PFKFB3表达明显升高(P<0.05),血浆乳酸含量明显升高(P<0.05);LPS注射28 d后,L组小鼠Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高(P<0.05),肺组织出现明显纤维化。结论:在LPS诱导的肺纤维化过程中,LPS可诱导肺成纤维细胞和肺组织中PFKFB3蛋白表达,该过程与其有氧糖酵解过程相关,PFKFB3的表达上调可能是LPS诱导肺成纤维细胞和肺组织有氧糖酵解和肺纤维化的关键环节。

PFKFB3基因在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞糖酵解及生长的影响

目的探讨6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3(PFKFB3)基因在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞糖酵解及生长的影响。方法收集我院病理科前列腺增生和前列腺癌蜡块组织,应用免疫组化技术检测PFKFB3的表达水平。通过荧光定量PCR和Western blot实验检测正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)和四种前列腺癌细胞系(PC3、LNCaP、DU145、C4-2)中PFKFB3的表达。应用RNA干扰技术敲低PFKFB3表达,采用细胞糖酵解试剂盒、CCK-8和克隆形成实验检测PFKFB3对前列腺癌细胞的糖酵解和增殖活性的影响。结果与前列腺增生组织相比,前列腺癌组织中的PFKFB3表达量明显增高[(59.7±0.25)vs(3.08±0.16),P<0.05],且病理Gleason评分越高,PFKFB3表达量也越高。同样PFKFB3在不同前列腺癌细胞系中均明显高表达。抑制PFKFB3基因表达后,前列腺癌细胞的糖酵解和增殖能力显著降低。结论PFKFB3基因在前列腺癌恶性进展中表达上调,促进肿瘤细胞的糖酵解和增殖,靶向PFKFB3可能为前列腺癌分子诊断和治疗提供潜在的应用价值。

PFKFB3对宫颈癌细胞影响机制探讨

目的肿瘤细胞产生能量的方式是糖酵解,且糖酵解与恶性肿瘤发生、发展及转移密切相关,因此糖酵解中涉及的限速酶可能是恶性肿瘤治疗重要靶点。本研究分析宫颈癌细胞中糖酵解限速酶6-磷酸果糖2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)的表达水平,并探讨PFKFB3对宫颈癌细胞生长、迁移、体内成瘤的影响,以期为宫颈癌治疗提供新思路。方法免疫荧光技术和蛋白质印迹法检测人宫颈癌Hela细胞和正常上皮细胞中PFKFB3的表达。腺病毒载体抑制Hela细胞中PFKFB3的表达,并观察PFKFB3沉默对细胞生长、迁移、体内成瘤的影响。结果细胞免疫荧光和蛋白质印迹法结果显示,Hela细胞中PFKFB3表达水平明显高于正常上皮细胞。抑制Hela细胞PFKFB3表达,可抑制Hela细胞体外增殖、迁移和侵袭。裸鼠移植瘤模型结果显示,Sh-PFKFB3-Hela细胞组肿瘤体积(514±147)mm3明显小于Hela细胞组肿瘤体积(1 424±254)mm3,差异有统计学意义,t=3.53,P=0.000 1。Sh-PFKFB3-Hela细胞组肿瘤质量(301±74)mg小于Hela细胞组肿瘤质量(623±87)mg,差异有统计学意义,t=4.34,P=0.006。肿瘤组织免疫荧光染色结果显示,Sh-PFKFB3-Hela细胞肿瘤标本中Ki-67表达阳性率为(11.3±1.2)%,明显小于Hela细胞组阳性率(41.5±3.2)%,差异有统计学意义,t=3.34,P=0.002。裸鼠肺转移模型结果显示,单位面积内Sh-PFKFB3-Hela细胞组平均肺部转移灶数目为3.5个,明显少于Hela细胞组平均转移灶数目13个,差异有统计学意义,t=4.33,P=0.003。结论 Hela细胞中高表达的PFKFB3在Hela细胞增殖、迁移、体内成瘤及转移等生物学过程中起重要作用。抑制PFKFB3可能作为宫颈癌生物治疗的分子靶点。