丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析。方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平。结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值。结论:从丹参毛状根中克隆得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因。

胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析

目的研究胡黄连Picrorhiza kurrooa 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶(MCT)基因特征并预测MCT结构与功能位点。方法以胡黄连MCT基因为研究对象,利用NCBI网站及生物信息学软件对其碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、保守区及二级结构和三级结构进行预测和分析;并对9个物种的MCT基因进行多重比对与进化分析。结果胡黄连MCT基因的mRNA序列长为1 216 bp(GenBank JQ991625.1),编码由399个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质相对分子质量为44 448.5,其中量最高的为Ser(10.0%);整个多肽中疏水性氨基酸占59.5%,平均疏水值为0.050;与丹参Salvia miltiorrhiza MCT氨基酸序列对比同源性最高,达99%。结论胡黄连MCT基因处于稳定状态,编码的蛋白为疏水性蛋白,在进化过程中是相对保守的,获得的保守区段序列信息为其他物种MCT基因的克隆奠定了基础。

通过扩大非甲羟戊酸途径以实现S-柠檬烯在E.coli中的生物合成

单萜烯系香叶基焦磷酸(GPP)环化后的产物.其在食品化工医药能源等领域具有广泛的应用.目前,单萜烯主要从植物精油中纯化获得,因而产量受到限制.代谢工程是近来的新兴生物工程技术.通过改造代谢通路,可以实现在微生物中生产各类重要的产物.要实现单萜烯的微生物生产,除了要引入相应的萜烯合成酶外,还需要提高其上游产物,即异戊二烯焦磷酸(IPP)和GPP的供给.在本项工作中,我们首次通过放大E.coli的非甲羟戊酸途径,增加了IPP前体的合成,再结合引入GPP合酶及S-柠檬烯合成酶,实现了在细菌内生物合成S-柠檬烯.本研究为未来通过微生物发酵方法生产各类单萜烯产物提供了基础.

顶复门原虫类异戊二烯生物合成途径及其关键酶的研究进展

顶复门原虫包括疟原虫(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、艾美耳球虫(Eimeria spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)、泰勒虫(Theileria spp.)及巴贝斯虫(Babesia spp.)等一大类引起严重人畜疾病的寄生性原虫。顶复门原虫利用2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成类异戊二烯前体物质,这些化合物对于维持顶复门原虫的生存具有十分重要的作用。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)还原异构酶是MEP途径的关键酶,对其作用机理及抑制剂的筛选研究已取得重要进展。论文对顶复门原虫类异戊二烯的MEP途径,DOXP还原异构酶的作用机理及靶标研究进展进行综述。

顶复门寄生虫类异戊二烯酸代谢途径的研究进展

顶复门寄生虫是一类细胞内专性寄生原虫,包括弓形虫、疟原虫、泰勒虫及巴贝斯虫等,它们能够引起人和动物的疾病,并造成严重的经济损失。2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径是顶复门寄生虫类异戊二烯酸的特殊代谢途径,对维持虫体的生存有重要作用,而且该途径中的各种酶也成为科学工作者们研究的热点。本文对顶复门寄生虫类异戊二烯酸代谢途径的研究现状进行了综述。

药用植物类异戊二烯代谢途径及其活性产物合成调控研究进展

植物类异戊二烯化合物是一类具有多种药理活性的天然产物,其生物合成主要通过甲羟戊酸途径与2C-甲基-4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径,对这两条途径的调控研究已成为近年来热点之一。本文就近年来植物类异戊二烯代谢途径的研究进展以及相关活性成分的生物合成调控研究做一综述。

利用MEP途径过表达提高β-胡萝卜素产量

构建上游甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径,获得两种重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF和pTrcHis2B-dxs-idiispDF,然后与下游β-胡萝卜素合成途径的质粒pACYC184-M-crt一起转化进入大肠杆菌中,获得相应的重组菌株。结果表明含有MEP途径的重组菌株β-胡萝卜素产量有显著提高。

植物类异戊二烯生物合成相关酶基因研究进展

类异戊二烯化合物是自然界广泛存在的一大类天然化合物,具有重要的生物学功能及经济价值.在植物体内,类异戊二烯化合物的生物合成主要有2条代谢途径:甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径.综述了国内外对植物中这2条代谢途径中相关酶基因的功能、分离情况、表达特性,以及2条代谢途径之间中间产物的交换等方面的研究进展.

莱茵衣藻对MeJA处理的初期响应模式分析

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是植物次生代谢的调节剂,参与异戊二烯代谢调控,对莱茵衣藻的异戊二烯类物质合成有重要影响.为探究莱茵衣藻如何快速响应MeJA处理,测定MeJA处理下莱茵衣藻的生长状态和光合效率等生理特征参数,重点关注MeJA处理24 h内2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methnatureyl-D-rythritol-4-phosphate,MEP)合成途径、类胡萝卜素合成途径和甾醇合成途径关键基因的表达水平变化.结果表明,MeJA处理降低了莱茵衣藻的生物量积累和光合活性,上调了MEP通路和甾醇合成通路相关基因,下调了类胡萝卜素合成途径的关键基因.在转录与生理层面,莱茵衣藻对于MeJA处理的初期响应具有快速与剂量依赖性的特点.研究结果为探索微藻类异戊二烯合成和代谢机制提供理论参考.

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆Tw MCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）,以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后0~72 hTwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1 318 bp TwMCT全长c DNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究。方法根据黄花蒿MCS(AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列。将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a(+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白。半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况。结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子。构建pET-21a(+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a(+)-MCS原核表达体系。AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低。结论克隆了AaMCS基因,建立pET-21a(+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础。

芒果MDS家族基因的鉴定、进化及表达分析

2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MDS)是MEP代谢途径中的关键酶。为了鉴定芒果中的MDS家族基因,探索MDS家族基因的进化、表达模式。本研究采用同源搜索的方法,从13个植物基因组中下载了16个MDS家族基因,对其进行了蛋白结构域、系统发育及在芒果中的表达分析。蛋白结构域分析结果显示,芒果MDS家族基因的蛋白序列均包含完整的PF02542.16结构域。系统发育进化树显示,芒果中的MDS家族基因是在双子叶植物形成后进化的,且与柑橘的MDS基因关系最近。表达分析结果显示,在芒果品种‘贵妃’、‘台农’和‘金煌’的成熟果果肉中,芒果MDS家族基因均在‘贵妃’中表达量最高,其次是‘台农’,在‘金煌’中表达量最低,而且差异显著。本研究为进一步研究芒果MDS家族基因在萜类合成途径中的作用提供科学依据。

以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究

目的:筛选靶向结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase,Isp D)的新型抗结核化合物,研制具有全新作用机制的新型抗多药耐药MTB药物。方法:应用高通量的微生物体外微量、直观快速的药敏试验方法,筛选得到具有抑制MTB生长的阳性化合物;同时在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中重组表达MTB的Isp D,建立酶活测定方法,构建Isp D酶抑制剂筛选模型,从具有抑制MTB生长的阳性化合物中筛选Isp D抑制剂;对在酶水平上具有良好抑制活性的化合物进行作用机制研究,确定其对MTB(H37Rv)的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),评价其抗菌谱,测定其对非洲绿猴肾细胞(Vero)和人肝癌细胞(Hep G2)的毒性。结果:从4万多个化合物中初步得到了159个具有抑制MTB生长的阳性化合物,从中筛选得到了5个Isp D的抑制剂,其中的IMB-4901显示出较好的Isp D抑制活性(50%inhibiting concentration,IC50=19.3μg·m L-1)和抗MTB活性(MIC=1.6μg·m L-1)。结论:成功获得了以Isp D为靶点的新型抗MTB药物先导化合物。