中药成分小檗碱对小鼠2-细胞胚胎体外培养及移植效果的研究

以添加抗菌素的mCZB液为对照组,筛选比较了中药有效成分小檗碱不同浓度对小鼠2-细胞胚胎体外培养效果的影响,并计数所培养的孵化胚胎细胞数目,观察中药有效成分对胚胎细胞数目增殖的作用;通过将体外培养发育的囊胚进行移植,进一步验证其对小鼠胚胎移植效果和产仔发育的影响。结果表明:小檗碱最佳浓度为0.10μg/mL,120h孵化胚胎发育率和孵化胚胎细胞数目(89.9%,83.7±9.10)极显著高于对照组(50.7%,69.5±7.14)(P<0.01);小檗碱组培养囊胚移植妊娠率(66.7%)和离窝成活率(55.8%)均显著高于对照组(50.0%,45.2%)(P<0.05),其组间产仔率、初产仔鼠平均体重、离窝小鼠平均体重无显著差异(P>0.05)。其结果说明,小檗碱对体外胚胎生长发育和细胞增殖有促进作用,对胚胎附植及初生仔鼠无不良影响。

小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验在室温 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,利用不同浓度的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠 2 细胞胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻保存。在 2 0℃室温条件下 ,用EFS4 0平衡 1min细管一步法冷冻 ,解冻后囊胚发育率仅为35 .0 % ,和新鲜 2 细胞体外培养的对照组 (6 5 .0 % )的差异极显著 (P <0 .0 1)。当 2 细胞胚胎在 10 %EG +10 %D溶液中预处理 5min ,再移入EDFS中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后囊胚发育率达 4 7.8%～ 4 8.8% ;当室温升至2 5℃时 ,二步法冷冻保存后 2 细胞的囊胚发育率达到 5 2 .2 % ,与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的 2 细胞胚胎的囊胚发育率高达 6 2 .2 % ,为试验中的最佳组。

小鼠2-细胞胚胎ATP合成酶6基因特异表达分析及鉴定

合子基因组活化是小鼠胚胎早期发育由细胞质调控向核调控转变的关键 .小鼠合子基因组活化发生在 2 细胞胚胎阶段 ,通过对 2 细胞胚胎阶段特异性表达基因的分析 ,可以从分子水平上揭示早期小鼠胚胎的发育机理 .用DD RTPCR技术 ,从单个小鼠 2 细胞胚胎与成熟卵母细胞 (MII细胞 )中分离了 2个差异片段 ,片段 2同小鼠睾丸中表达的一个未知片段具有高度同源性 .经过cDNA文库构建、筛选 ,分离到其全长cDNA .序列分析结果表明 ,该基因为小鼠ATP合成酶亚单位 6基因 .ATP合成酶亚单位 6基因由线粒体DNA编码 ,与细胞内ATP的合成相关 .小鼠 2 细胞胚胎特异表达的ATP合成酶亚单位

四种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎渗透性和毒性作用的比较

作为胚胎冷冻保存的基础性研究,冷冻保护剂的渗透性和毒性研究非常重要。本试验选用1,2-丙二醇、甘油、乙二醇和二甲基亚砜4种常用冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚胎进行渗透性和毒性研究。结果显示:1.5mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显著高于甘油保护剂;4种冷冻保护剂对细胞膜的完整性没有影响;1.5mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂处理后的2-细胞胚胎的囊胚发育率和孵化率与对照组胚胎比较差异不显著(P>0.05),但显著高于二甲基亚砜处理后的2-细胞囊胚发育率和孵化率(P<0.01)。结果表明:在4种冷冻保护剂中,乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存。

DAP玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3个品系(C57BL/6、Apo E-/-、NOS3-/-)SPF级4周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果 C57BL/6、Apo E-/-、NOS3-/-3个品系小鼠超数排卵平均值分别为42.98个/只、27.93个/只、23.11个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68.79%、32.70%、23.08%,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72.77%、80.87%、83.33%,存活率分别为56.92%、54.84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72.37%、60.78%、25%。结论选择4周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。

PGE_2、PGF_(2α)和Iloprost对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响

目的研究PGE2、PGF2α以及Iloprost(PGI2的稳定类似物)对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。方法在含0.5%BSA的mCZB液中分别添加0、10-4、10-5和10-6mol/L的PGE2,0、10-4、10-5和10-6mol/LPGF2α以及0、1×10-6、2×10-6和4×10-6mol/LIloprost,观察小鼠2-细胞胚胎的体外发育,同时利用H33342染色进行囊胚和孵化囊胚的细胞核计数。结果添加PGE2、PGF2α以及Iloprost的各处理组2-细胞胚胎体外培养的囊胚率和孵化率均显著低于对照组(P<0.05),但各处理组与对照组之间在囊胚或孵化胚胎的细胞数上差异不显著(P>0.05)。结论培养液中添加这三种前列腺素均不利于小鼠2-细胞胚胎的体外发育,但不影响囊胚或孵化胚胎的细胞数。

猪2-细胞胚胎电融合

以湖北白猪为试验动物 ,研究了不同处理对猪 2 细胞胚胎电融合的影响 ,结果表明 :融合液的离子强度、电场强度、脉冲时程和交流电处理等均影响电融合的效率 ,以非电解质的甘露醇溶液为融合液 ,融合前交流脉冲处理 ,直流电场强度为 150 0～ 2 0 0 0V/cm和脉冲时程为 4 0～ 60 μs时可获得较高的融合效率。

离子浓度对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响

四倍体胚胎的制备已经成为生物学家研究小鼠以及其它哺乳动物发育生物学的有力工具。目前,制备小鼠四倍体胚胎最常用的方法是电融合法,其中电融合液中的离子种类和离子浓度是影响胚胎电融合成败的关键因素。本文比较了Ca2+、Mg2+、Sr2+、Na+、K+、Li+等阳离子对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响。结果发现,在100 V/mm电场强度、50μsec脉冲时程和2次脉冲的电融合条件下,少量二价阳离子的存在是胚胎融合所必须的,当Ca2+为0.1 mM时,可使全部胚胎发生电融合,而一价阳离子的存在不利于胚胎的电融合。随着各种离子浓度的大幅升高,胚胎的融合率急剧下降、胚胎死亡数量增加以及死亡程度加剧。

乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

目的评价用乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠2-细胞胚胎冷冻保存的效果。方法通过超排卵处理后与雄鼠交配获得长爪沙鼠2-细胞胚胎,胚胎在冷冻液EFS20中平衡3 min,然后移入冷冻液EFS40中平衡1 min,之后将细胞冻存管直接浸入液氮中保存。采用二步法复苏胚胎,复苏后移入改良的胚胎培养液(mKSOM)中体外培养。结果采用该方法冷冻的胚胎复苏后胚胎回收率为86.73%,存活率为82.94%,复苏后存活的胚胎中约1/3胚胎可以在体外发育到囊胚。结论乙二醇玻璃化冷冻液适于冷冻保存长爪沙鼠2-细胞胚胎。

山羊2-细胞胚胎的电融合试验

对山羊2-细胞胚胎的电融合参数进行了研究。结果表明,从融合率、卵裂率、胚胎死亡率三个指标综合衡量,电场强度1.2kV/cm,脉冲时程40μs是适宜的参数。

中药有效成分对小鼠2-细胞胚胎体外发育的作用

如何获得更多具有活力的可操作的桑椹胚、囊胚一直是胚胎体外培养的研究热点。近二十年来，虽经采用改进培养液成分、改善培养条件、建立体细胞与胚胎共培养体系和添加生长因子、细胞因子等手段，胚胎质量有所提高，但体外受精卵的囊胚发育率仍远低于体内受精，与体内受精囊胚相比，体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数量明显减少，胚胎移植妊娠率和产仔率较低，这些问题均严重影响了胚胎工厂化生产和胚胎产业化的发展。以及育种工作的进程。因此，探索开辟胚胎体外培养生长发育的新途径，提高其发育率和移植妊娠率显得尤为必要。目前，国内外有关中草药有效成分对体外胚胎发育作用的研究甚少。本研究以ICR小鼠2-细胞胚胎为试验材料，将中药有效成分黄芩苷（Baicalin，Bai）、川芎嗪（Ligustrazine，Lig）和小檗碱（Berberine，BR）添加于mCZB基础液中，并以添加双抗的mCZB基础液为试验对照组，比较其对胚胎体外发育的影响。结果表明，体外培养120h的胚胎孵化率，Bai组（80．6％）、Lig组（78．3％）及BR组（75．9％）极显著高于对照组（51．8％）（P〈0．01）。孵化胚胎细胞计数，BR组、Lig组和Bai组（分别为87．2±8．6、83．9±7．7和81．9±6．2），与对照组（77．4±5．6）差异极显著（P〈0．01）。说明3种中药有效成分均能显著促进小鼠早期胚胎的体外发育及胚胎细胞增殖。为进一步探讨Bai、Lig、BR对胚胎体外培养发育的效果和验证其胚胎质量，将不同组别培养至桑椹、囊胚期的胚胎进行两种程序常规冷冻，解冻后继续培养，观察其冷冻效果，并将各组解冻后发育至囊胚期胚胎移植。结果表明：冷冻解冻桑椹胚体外培养8～14h囊胚发育率，程序一中Bai组（65.8％）和Lig组（81．1％）分别显著（P〈0．05）和极显著（P〈0．01）地高于对照组（48．6％）和BR组（46．7％）；程序二中Bai组（80．6％）、Lig组（78．3％）极显著高于对照组（55．2％）和BR组（47．6％）（尸〈0．01）。冷冻解冻囊胚体外培养6～8h囊胚发育率，程序一中各组间无显著差异（P〉0．05）；程序二中，中药有效成分各组间差异不显著（P〉0．05），但均显著高于对照组（P〈0．05）。两种冷冻程序效果差异不显著（P〉0．05）。移植妊娠率和产仔率，Bai组（56．3％，63．39／5）、Lig组（52．6％，67．3％）和BR组（55．0％，60．5％）均高于对照组（46．2％，52．8％）。说明3种中药有效成分对于提高小鼠2-细胞胚胎体外发育质量具有一定促进作用，并有利于提高冷冻解冻后移植胚胎的发育潜力。

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究(简报)

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。

不同来源小鼠2-细胞胚胎体外发育情况的比较

目的比较小鼠配子体外授精法与2-细胞胚胎收集法所得鼠胚体外发育情况,探讨适合人类体外受精实验室的质量控制系统。方法采用雌雄小鼠配子体外授精和体内受精收集2-细胞胚胎,同时对2-细胞胚胎在相同条件下进行体外培养,观察胚胎发育情况。结果小鼠配子体外授精法的受精率为82.2%;对两种方法所获2-细胞胚胎进行培养,48 h卵裂率及72 h囊胚形成率均无显著差异。结论体内受精2-细胞胚胎收集法较小鼠配子体外授精法操作简便,是较理想的人类胚胎实验室质控方法。

短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用

为研究短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用,对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎解冻后进行短期(2～4 h)培养,然后使用20%的低渗PBS液于25℃条件下处理20 min,观察48 h发育率、囊胚率和移植后妊娠率、产仔率。获得93%的48 h发育率和48%的囊胚率,显著高于低渗处理前未培养组(47%和9%)(P＜0.05)。证明解冻后的短期培养中可以有效修复玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的损伤。

补肾法通过三羧酸循环酶改善重复控制性卵巢刺激模型小鼠2-细胞胚胎发育潜能

目的 通过观察胚胎合子基因组激活期(ZGA)三羧酸循环(TCA)酶和表观遗传修饰的关系,研究补肾调经方改善重复控制性卵巢刺激(COS)模型小鼠的2-细胞胚胎发育潜能。方法 将动情周期正常的雌性小鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、补肾低剂量组和补肾高剂量组,每组25只。除正常组外,其余各组小鼠建立COS模型。模型组和补肾低、高剂量组每日上午9时分别灌胃蒸馏水、补肾调经方低剂量(25.6 g/kg)和高剂量(51.2 g/kg),连续10 d。于第11天16时腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只,第13天16时腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只;正常组注射生理盐水0.1 mL。灌胃及腹腔注射连续3个周期,每个周期间隔4 d。各组小鼠第3次腹腔注射后立即与同品系雄性小鼠合笼。次日清晨见栓或阴道涂片见精子的雌鼠记为妊娠。妊娠小鼠于末次腹腔注射hCG后44~46 h处死,在倒置显微镜下取出2-细胞胚胎观察形态并计数。免疫荧光法检测2-细胞胚胎丙酮酸脱氢酶(PDH)、柠檬酸合成酶(CS)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)、组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化修饰(H3K9ac)的蛋白表达;RT-PCR法检测2-细胞胚胎PDH、CS、IDH3A、SOX2的mRNA表达。结果 与正常组比较,模型组2-细胞胚胎数量增加(P<0.05),形态明显破碎,发育较差;PDH、CS、IDH3A、SOX2的mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05),H3K9ac蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,补肾低、高剂量组2-细胞胚胎数差异无统计学意义(P>0.05),形态发育完整,碎片较少;PDH、CS、IDH3A、SOX2的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),H3K9ac蛋白表达降低(P<0.05)。结论 补肾调经方可在ZGA影响重复COS小鼠2-细胞胚胎的表观遗传修饰,改善胚胎发育潜能,推测其作用机制可能与影响TCA酶有关。

小鼠2-细胞胚胎电融合的研究

本试验对影响小鼠2-细胞胚胎电融合诸因素进行了研究。胚胎细胞融合面与两电极相平行或相垂直;胚胎细胞在0.3 mol/L甘露醇液、0.25mol/L蔗糖液和杜氏磷酸缓冲液(PBS)中;当电脉冲的持续时间为80μs,电场强度为0,800,1000,1200,1400和1600V/cm时以及当电脉冲的电场强度为1200V/cm,持续时间为10,20,40,80,160和320μs时,胚胎细胞融合效果的比较结果表明:融合面与两电极相平行,以0.3mol/L甘露醇液为融合液,电脉冲在1000—1200V/cm,20—160μs范围内的条件下,可获得满意的胚胎细胞融合率(88.6—94.5％),平均为92.2％。

Cdc25B蛋白过表达可使小鼠胚胎突破2-细胞期阻滞

目的:探讨Cdc25B蛋白过表达对小鼠2-细胞期胚胎发育的影响。方法:利用体外转录试剂盒将Cdc25B转录成mRNA,将mRNA显微注射入小鼠2-细胞期胚胎中,观察胚胎发育情况和卵裂率。用蛋白激酶活性测定方法和Western印迹分别检测Cdc25B蛋白过表达小鼠胚胎MPF的活性及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。结果:hCG后48 h,mRNA注射组有超过40%的2-细胞期胚胎分裂到4-细胞期而对照组仍停留在2-细胞期;激酶活性测定显示注射Cdc25B mRNA后,MPF的活性显著升高;Cdc2-Tyr15的磷酸化状态变化与激酶活性测定结果一致。结论:Cdc25B蛋白过表达可以激活有丝分裂促进因子(MPF),从而使小鼠2-细胞期胚胎突破2-细胞期阻滞,发育到4-细胞期。

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.

两种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚冷冻效果的比较

乙二醇(ETG)和1,2-丙二醇(PROH)具有高细胞渗透性和低毒性特点,常被用于人及多种哺乳动物早期胚胎冷冻保存。为了比较ETG和PROH对小鼠2-细胞胚的冷冻保护效果,本试验分别采用这两种冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚进行冷冻保存,并采用冻后体外培养和囊胚移植进行冷冻效果检测。结果表明,PROH组胚胎解冻后胚胎存活率与ETG组无显著差异,但PROH组4-细胞胚发育率和囊胚发育率显著高于ETG组(82.7%vs.64.6%,61.2%vs.29.1%,P<0.01)。囊胚移植结果表明,2-细胞胚胎冻存后能够发育为正常的后代,PROH组和ETG组的囊胚移植后妊娠产仔率无统计学差异(P>0.05),但均显著低于对照组(P<0.05)。为了分析两组胚胎冻存后损伤情况,对解冻后的胚胎细胞微丝进行检测,结果显示ETG组微丝受损的胚胎数高于PROH组。本研究结果证明采用PROH作为冷冻保护剂冷冻保存小鼠2-细胞胚的冻存效果优于ETG。

序贯培养对小白鼠胚胎体外发育的影响

目的:探索序贯培养技术对小白鼠胚胎体外发育的影响。方法:将 2 -细胞期的小鼠胚胎随机分为序贯培养组与传统培养组进行培养 ,观察分析两组的 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率。结果:序贯培养组 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率分别为 70 .5 %、6 8.2 %、6 5 .9% ,传统培养组分别为 4 5 .7%、4 5 .7%、34.3%。两组比较 ,序贯培养组高于传统培养组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :采用适当的培养液进行序贯培养 。