来自Staphylococcus aureus N315的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶的工程菌构建、表达纯化与性质鉴定

利用基因挖掘在数据库中发现一种来自Staphylococcus aureus N315的潜在DERA(SaDERA),将其基因密码子优化后实现了在大肠杆菌中的表达,重组酶经纯化后研究了其催化性质。结果表明:构建的工程菌具有较高的可溶表达量(占总蛋白的70%),通过简单的一步纯化即可得到电泳纯的酶;SaDERA是一种同源二聚体的酶(5.7×104),其最适反应条件是pH 7.7和45℃;SaDERA具有良好的碱耐受性,在pH 11.0、25℃的条件下温浴24 h后仍有93%的残余活力;SaDERA具有良好的乙醛耐受性,在0.3 mol/L乙醛浓度、25℃下,30 min内保持了70%以上的残余活力;乙醛连续自缩合产物被纯化并鉴定,所得产品为两次缩合产物。

2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达

为实现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶基因(DERA)在毕赤酵母中分泌表达。通过PCR从E.coli BL21基因组中扩增获得DERA序列,并且与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建得到重组质粒pPIC9K-DERA。重组载体经salⅠ单酶切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,用MD/MM平板筛选阳性株并在含G418的YDP培养基中筛选多拷贝插入菌株。经PCR鉴定获得一株插入pPIC9K-DERA的多拷贝嗜甲醇重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导该重组菌株,分泌得到具有活性的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶,且72 h时酶活为2.4 U·mg-1。结果表明,2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶可实现在毕赤酵母中分泌表达。

酶法合成2'-脱氧-5-氟尿苷的研究

以化学合成的2-脱氧核糖-1-磷酸二环己胺盐和5-氟尿嘧啶为底物,在芽孢杆菌核苷磷酸化酶的作用下合成产物2'-脱氧-5-氟尿苷。考察了诱导剂种类及浓度对菌体核苷磷酸化酶活力的影响,同时又考察了底物比例、底物浓度、菌体量、反应温度、缓冲液浓度及p H值等参数,得到最佳的条件为核糖浓度35 mmol/L,5-氟尿嘧啶为105 mmol/L,磷酸钾缓冲液45 mmol/L(p H 8.0),游离芽孢杆菌12%(湿重)在55℃下反应3 h,转化率可达79.36%,产量可达6.83 g/L。采用该法合成2'-脱氧-5-氟尿苷,反应条件温和,同时能够一定程度地解决酶法合成脱氧核苷中脱氧核糖供体来源少、价格高的问题,具有一定的工业化价值。

嗜热微生物中获取耐乙醛变性醛缩酶

在催化他汀药物中间体合成中,对高浓度乙醛底物的耐受是醛缩酶的重要应用性质.通过克隆并在大肠杆菌中过表达了来源于嗜热微生物Geobacillusthermodenitrificans的耐热醛缩酶(DERAGth),该蛋白质序列长度为223aa,对应的分子量为25.0kD.初步酶学性质表征结果表明,该酶对天然底物2-脱氧核酸-5-磷酸的活力19.3U/mg,最适pH为7.5,最适温度为60℃.在40—100℃保温10min的结果表明,DERAGth具有较好的热稳定性,在60℃下10min活力仍保持100%.对乙醛耐受的实验表明,该酶在300mmol乙醛中25℃保温2h,剩余活力高于40%.连续醛缩活力对比实验结果表明,该酶的连续醛缩活力远大于来源于常温微生物的大肠杆菌醛缩酶.

响应面法优化大肠杆菌表达Hyperthermus butylicus耐热醛缩酶诱导条件的研究

为了提高重组耐热2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达水平,该文基于中心组合实验的响应面分析方法,对基因工程E.coli的诱导条件进行了优化,具体考察因素包括诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖,IPTG)浓度和诱导时机.实验结果表明该方法可以提高目标蛋白的表达量,依据回归分析确定了最佳诱导条件为:IPTG浓度0.57mM,诱导时机OD600为0.76,理论最佳DERA的比活力为1.124u/mg,而实际平均比活力达到1.178u/mg,两者几乎相等,说明该模型与实际情况基本相符.

顶复门原虫类异戊二烯生物合成途径及其关键酶的研究进展

顶复门原虫包括疟原虫(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、艾美耳球虫(Eimeria spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)、泰勒虫(Theileria spp.)及巴贝斯虫(Babesia spp.)等一大类引起严重人畜疾病的寄生性原虫。顶复门原虫利用2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成类异戊二烯前体物质,这些化合物对于维持顶复门原虫的生存具有十分重要的作用。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)还原异构酶是MEP途径的关键酶,对其作用机理及抑制剂的筛选研究已取得重要进展。论文对顶复门原虫类异戊二烯的MEP途径,DOXP还原异构酶的作用机理及靶标研究进展进行综述。

川西獐牙菜SmDXS2基因的克隆及表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个关键酶。该研究根据川西獐牙菜Swertia mussotii转录组数据,克隆获得其DXS2基因(Gen Bank注册号MH535905),命名为Sm DXS2。生物信息学分析表明Sm DXS2基因无内含子,其开放阅读框全长2 145 bp,编码714个氨基酸,分别属于20种氨基酸,其中丙氨酸、甘氨酸和色氨酸含量最高;相对分子质量为76. 91 k Da,理论等电点为6. 50,属亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋占36. 83%,延伸链占9. 38%,loop占53. 78%;序列内部无信号肽,没有跨膜区,为非分泌型蛋白;序列中含有TPP结合位点、嘧啶结合结构域和C端的转酮酶结构域;系统发育分析结果显示Sm DXS2与滇龙胆DXS2共聚于一个分支。Sm DXS2基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为94 k Da,与预测蛋白大小一致。该研究为进一步探讨该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了理论依据。