变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应(touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR)技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kgu E。将目的基因与质粒pET-28a(+)重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kgu E。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5 ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256个氨基酸残基组成的分子质量为28.5 ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。

镉超标大米水解糖发酵生产2-酮基葡萄糖酸过程中镉的迁移规律

目的揭示以镉超标大米为原料发酵生产2-酮基葡萄糖酸过程中镉的迁移规律,并获得符合食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠合成要求的2-酮基葡萄糖酸。方法以正常大米、镉超标大米和混合大米为原料,系统分析大米糖化、种子培养、2-酮基葡萄糖酸发酵、发酵产物提取等过程中镉的含量和分布,确定镉的迁移规律及其对2-酮基葡萄糖酸发酵性能和D-异抗坏血酸钠产品品质的影响。结果大米和碳酸钙中的镉含量对2-酮基葡萄糖酸发酵性能影响不显著(P>0.05);发酵产物的提取过程有效降低了2-酮基葡萄糖酸中的镉含量,提取过程中产生的酸化废渣(主要由硫酸钙和菌体组成)可富集90%以上的镉;以镉超标大米为原料制备的D-异抗坏血酸钠的质量符合国家标准要求,未检出镉的存在。结论该研究为综合利用镉超标大米生产2-酮基葡萄糖酸、进而生产高附加值的食品添加剂D-异抗坏血酸钠提供了理论依据和技术支撑。

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因的克隆与分析

该研究旨在克隆变形假单胞菌JUIM01的2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因kgu T,并明确其基本的生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组信息及其2-酮基葡萄糖酸操纵子的物理图谱设计简并引物,采用TD-PCR技术从变形假单胞菌中克隆到全长为1278 bp的kgu T,其核苷酸序列与Pseudomonas sp.CCOS191的编码2-酮基葡萄糖酸转运蛋白(Kgu T)的核苷酸序列的一致性为87%,编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白与Pseudomonas sp.M1的Kgu T在氨基酸序列上的一致性达90%,定位于细胞膜,是一个具有12个跨膜结构的疏水性的跨膜蛋白,无信号肽,其二级结构中α螺旋、延伸链和无规卷曲所占的比例分别为75.76%、2.12%和22.12%。本研究首次从2-酮基葡萄糖酸的工业生产用菌中克隆到基因kgu T,并对其进行了生物信息学分析,为变形假单胞菌的Kgu T的功能研究奠定了基础。

补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究

研究了补糖对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4生产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响,并在50kL发酵罐上进行了补料分批培养工业应用性试验。研究结果表明,采用补料分批培养方法,能有效提高发酵液中的产物浓度;开始补糖时发酵液中的残糖浓度以3%～6%为宜;补料分批培养方法及AR4菌株可用于2-酮基-D-葡萄糖酸的工业化规模生产中。

2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研究进展

2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)是合成食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠及D-异抗坏血酸的前体,通常采用细菌发酵的方法由D-葡萄糖转化而来。本文概述了2KGA的生物合成途径、2KGA产生菌的选育、2KGA的发酵条件、2KGA的发酵工艺、2KGA发酵产物的提取、国内2KGA发酵生产中存在的主要问题及改善对策等。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌球状节杆菌K1022抗噬菌体菌株的选育

从 2 酮基 D 葡萄糖酸产生菌球状节杆菌K10 2 2的异常发酵液中分离到 3种噬菌体 ,分别将其命名为KS2 11、KS2 12和KS2 13。采用紫外诱变或自然选育的方法 ,获得了 6株具有抗噬菌体能力的 2 酮基 D 葡萄糖酸高产菌株。研究了抗株C2 2 4和K2 32的遗传稳定性 ,并在 5 0kL的发酵罐上进行了发酵生产试验。结果表明 ,经多次传代 ,菌株C2 2 4和K2 32对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变 。

荧光假单胞菌AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵条件的研究

以淀粉水解糖为碳源,研究了不同氮源、碳氮比、金属离子、接种量以及环境因子(培养基起始pH值、通气量、温度)对抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响。结果表明,氮源、碳氮比、培养基的起始pH值、通气量及温度对该菌的产酸均有显著影响。在适宜培养条件下,该菌的摇瓶产酸及发酵转化率分别可达13.5%和90%左右。

由2-酮基-D-葡萄糖酸直接合成异Vc的研究

以2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KG)为原料,在酸催化下直接合成异Vc;用TLC法定量测定异Vc含量;考察了反应温度、反应时间、催化用酸的种类和用量、2-KG浓度等因素对异Vc收率的影响,并从理论上对反应结果进行了探讨。

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46抗噬菌体菌株的选育

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46的异常发酵液中分离到1种噬菌体,将其命名为KS461。透射电镜观察表明,KS461呈近球形,直径为52nm。以荧光假单胞菌A46为出发菌株,利用紫外诱变的方法,获得了4株对噬菌体KS461具有抗性的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株,并研究了这些变异株的遗传稳定性。研究结果表明,经8次传代,这些变异株对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变。

旋光法测定发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

通过测定发酵液的旋光度及其葡萄糖质量浓度,计算发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度,并考察该方法实际应用的可行性。结果表明:对照品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系,R2>0.9999;该方法精密度、稳定性和重现性良好,2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率为102.60%,RSD为2.17%(n=5)。该方法可用于发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量检测。

高浓度发酵及膜分离技术在2-酮基-D-葡萄糖酸生产中的应用研究

研究中和剂和底物总浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸补料分批发酵的影响,并初步考察膜分离技术在发酵产物提取中应用的可行性。结果表明:在2-酮基-D-葡萄糖酸的补料分批发酵中,以NaOH或Na2CO3代替CaCO3作为中和剂,能够有效提高发酵培养基中的底物总浓度,且发酵转化率可达90%左右;在NaOH或Na2CO3作为发酵中和剂的情况下,膜技术可应用于2-酮基-D-葡萄糖酸的提取中,且有助于其提取率的提高。

碘量法测定发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

在优化样品处理条件的基础上,考察葡萄糖对2-酮基-D-葡萄糖酸测定的影响,改进发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的碘量法测定技术。结果表明:滴定样品溶液所消耗的I2标准溶液的体积、样品溶液中2-酮基-D-葡萄糖酸质量浓度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系,R2>0.9999;该方法精密度、稳定性和重现性良好,2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率为95.68%,RSD为1.35%(n=5)。该方法准确、快速,操作简便,可用于发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量检测。

噬菌体污染对荧光假单胞菌K10052-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响

在实验室条件下,考察了噬菌体污染对荧光假单胞菌K1005的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的危害。研究结果表明,发酵早期的噬菌体污染减缓菌株对葡萄糖的利用,导致发酵周期大大延长和发酵转化率明显降低。

玉米浆粉预处理对粘质沙雷氏菌发酵产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响

通过比较不同预处理方法获得的玉米浆粉在粘质沙雷氏菌SD136作用下产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响,组合复配玉米浆粉,结果表明:最佳玉米浆粉复配比为玉米原浆粉和酶解玉米浆粉3∶1,2-酮基-D-葡萄糖酸产量达到(171.39±4.5)g/L,发酵时间由40 h缩短至37 h,对糖转化率达到95.22%。玉米原浆粉和酶解玉米浆粉的组合复配能够提高粘质沙雷氏菌SD136的发酵效率和2-酮基-D-葡萄糖酸的产量。

球形节杆菌C224分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸的条件优化及其动力学模型的构建

通过优化发酵条件,提高球形节杆菌C224菌株利用大米淀粉水解糖分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸的生产强度,并在此基础上构建其发酵动力学模型。在50 L的发酵罐上考察了通气量与葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响,并基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程和物料平衡计算分别构建了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型。研究结果表明,通气量低于1.5 v.v-1.m-1时,发酵生产强度明显减小,糖酸转化率有所降低;发酵培养基中的葡萄糖浓度以120.0～180.0 g/L为宜,过高或过低对生产强度和糖酸转化率均有不利影响。在适宜的发酵条件下,球形节杆菌C224菌株分批发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的生产强度达6.36～6.54 g/(L.h),糖酸转化率为0.96～0.97 g/g。所构建动力学模型的计算值与实验值拟合效果良好,各项模型的相关系数R2均大于0.95,说明其能够揭示球形节杆菌C224分批发酵2-酮基-D-葡萄糖酸代谢基本特征。

工业生产条件下噬菌体对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响(英文)

考察了工业生产条件下噬菌体对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的危害,并研究了噬菌体侵染后菌体形态、种子培养过程和发酵过程的变化。研究结果表明,噬菌体侵染导致了发酵转化率的下降、发酵周期的延长和发酵液过滤速率的降低。发酵前期、中期和后期的噬菌体侵染所造成的危害差异显著(p<0.01),侵染时期愈早所造成的危害愈大。

荧光假单胞菌AR4在2-酮基-D-葡萄糖酸工业生产中的应用研究

在噬菌体存在的情况下,采用抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AR4在200m3发酵罐上进行了2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵生产。结果表明,荧光假单胞菌AR4对生产环境中噬菌体的抗性稳定,发酵周期短,发酵转化率高;经过10次传代,荧光假单胞菌AR4对噬菌体的抗性及其发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的能力没有改变;该菌株的发酵产物可以用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠的合成。

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸操纵子的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸操纵子(kgu操纵子),明确其基因组成及生物学信息。根据报道的假单胞菌的基因组信息设计简并引物,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的kgu操纵子,对克隆的基因片段进行测序,在此基础上利用生物信息学方法进行分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为6 130bp,其中包括基因ptx S、kgu E、kgu K、kgu T和kgu D,分别编码2-酮基葡萄糖酸代谢调控蛋白Ptx S、2-酮基葡萄糖酸差向异构酶、2-酮基葡萄糖酸激酶、2-酮基葡萄糖酸转运蛋白和2-酮基葡萄糖酸-6-磷酸还原酶;这些基因与铜绿假单胞菌PAO1的kgu操纵子中相应基因的序列一致性达56.15%~76.74%,然而变形假单胞菌的ptx S很可能并不位于kgu操纵子中。研究首次从变形假单胞菌中克隆到kgu操纵子,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸代谢机理的研究奠定了基础。

利用荧光假单胞菌固定化细胞生产2-酮基-D-葡萄糖酸

以海藻酸钠为载体固定荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4,考察固定化细胞发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的条件。结果表明:利用5.0%海藻酸钠制备的固定化细胞颗粒稳定性好,可重复利用7次;发酵培养基中玉米浆的最适质量浓度为0.75g/100mL,固定化细胞的适宜发酵温度为30～36℃;在适宜的培养条件下,固定化细胞与游离细胞的2-酮基-D-葡萄糖酸产量及糖酸转化率基本相同,分别可达13.5g/100mL和90.0%左右。