欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列 ,利用PCR技术 ,从克隆质粒和欧文氏菌 (Erwiniasp .)SCB1 2 5染色体中重新扩增得到含有 2 酮基醛糖还原酶A和B( 2 KRA和B)基因的片段 ,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体 pBL并转化大肠杆菌DH5α后 ,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上 ,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记 ,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR32 2上 ,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换 ,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢 ,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体 2 酮基古龙酸 ( 2 KLG)打下基础。