ERK1/2和p38MAPK介导BAPTA-AM抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究

目的探讨BAPTA-AM对RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞能力的影响以及其信号通路机制的研究。方法体外分离培养小鼠骨髓巨噬细胞,建立RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞的实验模型。应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法检测RANKL诱导的小鼠破骨细胞分化和存活的能力及BAPTA-AM对其的抑制作用;采用免疫印迹法(Western blot)测定ERK1/2和p38MAPK蛋白的磷酸化水平。结果 RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞胞质内可见多核,并能分化成为破骨细胞。不同浓度的BAPTA-AM(1、2μmol·L-1)对破骨细胞的形成具有明显的抑制作用,且随着浓度增加能明显地降低TRAP阳性细胞数目。RANKL对小鼠骨髓巨噬细胞的ERK1/2和p38MAPK具有明显的激活作用,诱导胞质ERK1/2和p38MAPK磷酸化,而不同浓度的BAPTA-AM可明显地抑制这种磷酸化作用。结论 BAPTA-AM能明显地抑制RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞分化成破骨细胞,这种抑制作用可能是通过ERK1/2和p38MAPK信号蛋白介导。

BAPTA-AM对OGD-再灌致HepG-2细胞损伤的保护作用研究

观察BAPTA-AM抗OGD-再灌对HepG-2细胞的损伤作用及其机制.在氧/糖剥夺环境中培养细胞12h后复糖复氧,检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的活性,MTT法检测细胞活力,Annexin V-EGFP/PI荧光染色检测细胞死亡率,A23187拮抗实验及Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度等方法,评价BAPTA-AM抗氧/糖剥夺-再灌注致HepG-2细胞损伤的作用.BAPTA-AM能明显抑制OGD-再灌引起的HepG-2细胞培养液中的LDH、ALT、AST水平的升高,抑制HepG-2细胞的坏死和细胞内游离钙浓度的升高,明显提高HepG-2细胞活力,A23187减弱BAPTA-AM保肝作用.BAPTA-AM通过降低细胞内游离钙浓度,明显减轻OGD-再灌对HepG-2细胞的损伤.

BAPTA-AM对HepG-2细胞MT的保护作用及其机制

目的观察BAPTA-AM抗H2O2诱导的HepG-2细胞MT损伤作用并探讨其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)、Rhodamine 123(Rh 123))荧光染色、细胞色素C酶联免疫分析、Caspase-9活性检测试剂盒、活性氧ROS检测法分别测定HepG-2细胞活性、线粒体(MT)膜电位、MT细胞色素C(CytC)的释放、Caspase-9的激活、活性氧(ROS)的产生量。结果 BAPTA-AM能抑制H2O2损伤HepG-2细胞所致MT跨膜电位的降低,减少CytC的释放,抑制Caspase-9激活和ROS的生成,提高受攻击H2O2的细胞活力。结论 BAPTA-AM通过减轻钙超载,保护MT,抑制凋亡通路的激活,产生抗细胞损伤、挽救细胞生命之效。

BAPTA-AM 脂质体通过恢复胞质钙稳态抑制D-GalN 致 HepG-2 细胞凋亡

目的探讨1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)恢复胞质钙离子稳态后对D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡的影响。方法建立D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡模型,采用MTT比色法、台盼蓝染色及AnnexinⅤ-EGFP、Hoechst-33258荧光染色等考察HepG-2细胞活性及细胞凋亡情况;通过Fura-2/AM钙离子荧光探针法测定不同处理组细胞内游离钙浓度,初步评价钙离子稳态与细胞凋亡的关系。结果 BAPTA-AM脂质体能显著抑制D-GalN致胞质钙离子浓度的升高,恢复胞质钙稳态,维持细胞形态,减少D-GalN诱导细胞凋亡。在一定范围内,细胞内钙离子浓度的增加与细胞活性的提高呈负相关,且钙离子载体A23187能够拮抗BAPTA-AM脂质体对HepG-2细胞的保护作用。结论BAPTA-AM脂质体通过减轻钙超载,抑制D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡。

用Fluo3-AM测定2型糖尿病患者淋巴细胞内Ca^(2+)浓度及药物对患者胞内Ca^(2+)浓度的影响

用 Fluo 3- AM为荧光探针 ,测定 2型糖尿病患者淋巴细胞内 Ca2 +浓度 ,观察了肾上腺素、多巴酚丁胺、Bay K 864 4、胰岛素等药物对胞内 Ca2 +的作用机制。实验表明患者胞浆内 Ca2 +浓度与正常人相比显著升高 ;药物对胞内 Ca2 +的刺激表明 ,病人对外界钙激动剂更敏感。胰岛素能刺激胞内 Ca2 +浓度升高 ,其作用机制是激活钙离子通道。肾上腺素不仅能激活钙离子通道 ,也能促使钙从钙池中释放。上述研究也表明 Fluo- 3是有效的研究胞内 Ca2 +变化的荧光探针。 2型糖尿病的发生可能与 Ca2 +浓度升高有关 。

下调PTEN基因对缺氧损伤后海马神经元NR2B受体调控机制研究

目的:探讨用RNAi干扰技术下调第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)对缺氧损伤引起的神经元NR2B受体表达调控机制。方法:建立海马神经元培养缺氧缺糖(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,采用细胞比色分析(Colorimetric assay)法观察神经元膜表面NR2B含量,RT-PCR测定NR2B受体的mRNA的表达,采用Fura2-AM法测定胞内Ca2+浓度,AlamarBlue进行神经元活力分析。结果:shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中;细胞比色法显示神经元膜表面有大量NR2B表达,与PshGFP对照组相比shRNAspten治疗组NR2B含量明显降低(P<0.05),RT-PCR测定结果与细胞比色法结果基本一致;OGD损伤组比正常组胞内Ca2+浓度显著升高(P<0.05),转染PTEN基因后胞内Ca2+浓度比PshGFP对照组明显降低(P<0.05);无关对照PshGFP组神经元活力较正常对照组和治疗组均有显著下降(P<0.05)。结论:下调PTEN基因可降低NR2B的表达,阻断Ca2+内流,增加细胞活力,从而保护神经元损伤。

用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法

新型Ca^(2+)荧光指示剂F ura-2/AM由中国医学科学院药物研究所合成。本文详细介绍了用F ura-2/AM测定神经细胞、巨噬细胞和主动脉条平滑肌细胞内游离钙的方法。经比较,国产与Sigma产F ura-2/AM的质量相同。

应用Fura-2/AM检测分离的神经细胞内游离钙及其变化

本文以酶法制备新生大鼠脑细胞悬液,运用近年来发展起来的Fura-2技术,检测此神经细胞内游离钙(以下简写为[Ca^(2+)]i)及其变化。结果表明:在静息状态下,其[Ca^(2+)]i为240±5nmol/L。高钾去极化可使[Ca^(2+)]i成倍增加.钙拮抗剂verapamil和Ilifedipinc能阻断高钾升高[Ca^(2+)]i的作用。实验结果证明了所制备的神经细胞悬液的可用性及建立的Fura-2测定[Ca^(2+)]i方法的可靠性。

白芍总甙对大鼠腹腔巨噬细胞产生前列腺素E_2的作用及部分机制研究

白芍总甙（ＴＧＰ，０．０１～１００ｍｇ·Ｌ－１）对亚适浓度Ａ２３１８７（０．１μｍｏｌ·Ｌ－１）激活的大鼠腹腔巨噬细胞（ＰＭΦ）产生的前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）呈现低浓度促进和高浓度抑制的双向调节作用。而ＴＧＰ对最适浓度Ａ２３１８７（１μｍｏｌ·Ｌ－１）激活的ＰＭΦ产生的ＰＧＥ２呈浓度依赖性的抑制作用，其ＩＣ５０为１６．７ｍｇ·Ｌ－１。在整体模型上，ＴＧＰ（５０ｍｇ·ｋｇ－１×１０ｄ）能使佐剂性关节炎（ＡＡ）大鼠ＰＭΦ产生过高的ＰＧＥ２恢复正常水平。采用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光法测定ＴＧＰ对Ａ２３１８７（１μｍｏｌ·Ｌ－１）诱导正常大鼠ＰＭΦ胞内游离钙离子浓度［Ｃａ２＋］ｉ，发现ＴＧＰ（≤１０ｍｇ·Ｌ－１）对ＰＭΦ［Ｃａ２＋］ｉ无明显影响，而ＴＧＰ在（１０～１００ｍｇ·Ｌ－１）时，对ＰＭΦ［Ｃａ２＋］ｉ有一定抑制作用。提示高浓度ＴＧＰ对ＰＧＥ２的负向调节作用可能与抑制细胞内钙有关。

柴胡提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度和细胞内VCR蓄积的影响

目的:测定中药柴胡(BupleurumChineseDC,BCDC)提取物对人肝癌BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)和长春新碱(Vincristine,VCR)浓度的影响,探索柴胡提取物逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制。方法:以Fura2/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计分别测定不同条件下的BEL7402细胞内[Ca2+]i。高效液相色谱法测定BCDC作用于BEL-7402后细胞内VCR蓄积情况的变化。结果:柴胡提取物可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001),可使细胞内VCR浓度升高(P<0.01)。结论:柴胡提取物可以增加VCR在BEL7402细胞内的积聚浓度,部分逆转BEL7402细胞的多药耐药(multidrugresistance,MDR)。钙离子通道阻滞作用可能为柴胡提取物逆转BEL7402细胞多药耐药的机制之一。

Fura-2/AM荧光法测定日本血吸虫培养细胞内游离钙离子浓度

目的 研究用钙荧光探剂 (Fura- 2 / AM)检测静息状态下日本血吸虫培养细胞内的游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i) ,以及β-巯基乙醇对培养细胞 [Ca2 + ]i的影响。方法 将 18d虫龄的日本血吸虫童虫制成细胞悬液 ,贴壁法接种于 30 ml培养瓶中 ,培养液为 RPMI- 16 4 0含 2 0 %小牛血清及常量抗生素。在培养的 0 - 3d,制备日本血吸虫细胞悬液 ,采用 Fura- 2 / AM钙荧光探剂测定正常静息状态下及加入β-巯基乙醇后日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i。结果 正常静息状态下 ,培养 0 d的日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i为 188.2 nmol/ L ;培养 1- 3d的 [Ca2 + ]i两两比较差异无显著性(P>0 .0 5 ) ,它们的平均值为 (187.0± 10 .7) nm ol/ L ,与培养 0 d的 [Ca2 + ]i比较 ,差异也无显著性(P>0 .0 5 )。β-巯基乙醇可使日本血吸虫培养细胞内 [Ca2 + ]i明显升高 (P<0 .0 1) ,并随浓度的增加而升高。结论 培养 1- 3d,静息状态下日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i比较稳定 ,β-巯基乙醇能影响日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 +

Fura-2/AM 法和 MTT 法筛选多药抗药性逆转剂的比较

为了验证新方法Ｆｕｒａ２／ＡＭ法筛选多药抗药性逆转剂的效果，以新方法Ｆｕｒａ２／ＡＭ法与传统方法ＭＴＴ法进行筛选多药抗药性逆转剂的比较研究。结果显示Ｆｕｒａ２／ＡＭ法与ＭＴＴ法的筛选结果基本一致（相关系数γ＝０８６，Ｐ＜００１），且Ｆｕｒａ２／ＡＭ法有操作简单、快速、灵敏、重复性好及测定过程不需无菌操作等的特点，适用于大规模的筛选。

用Fura 2－AM检测血小板胞浆游离钙浓度

本文对应用荧光指示剂Ｆｕｒａ２－ＡＭ（国产）测定血小板胞浆游离钙浓度的某些实验条件进行了探讨。结果表明：实验最适ｐＨ范围为７．３５～７．４５。实验不受溶血、黄疸及高脂血样品的干扰。批内ＣＶ４．９８％，批间ＣＶ５．６％。正常成人参考值为１６７．７５±２０．６６ｎｍｏｌ／Ｌ。与使用进口Ｆｕｒａ２－ＡＭ（Ｓｉｇｍａ产品）检测结果比较，结果无统计学差异，相关系数：γ＝０．９８。

利用Fura-2/AM荧光探针法和LCSM法研究受磁场处理S.aureus细胞Ca^(2+)的跨膜行为

研究受脉冲磁场处理金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞Ca2+的跨膜行为,为此研究了表征S.aureus胞内Ca2+浓度变化Fura-2/AM荧光探针检测法,并检测了不同脉冲数下经脉冲磁场处理后S.aureus细胞荧光强度的变化,采用激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)观察了经脉冲磁场处理前后S.aureus胞内Ca2+浓度的变化。研究结果表明,Fura-2/AM可成功的负载于S.aureus中,可以应用于S.aureus胞内游离钙离子浓度变化的测定。经脉冲磁场处理后,S.aureus胞内钙离子浓度显著上升,且与活菌数的减少高度相关,相关度达到-0.989 15;胞内光点显著增多,光点荧光强度明显增大,说明大量胞外钙离子跨膜进入胞内。因此,可以判断微生物细胞膜通透性的改变和胞内Ca2+浓度的上升是高强度脉冲磁场具有杀菌作用的重要原因。

补脾方药对脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体及细胞内[Ca^(2+)]i作用的观察

目的:观察脾虚模型大鼠壁细胞胃泌素受体及受体后信号细胞内钙离子的变化,并观察补脾方药党参、白术、补中益气汤对其的影响。方法:大鼠壁细胞采用EDTA-Pronase酶法消化而来。胃泌素受体检测采用放射配基结合实验,壁细胞内[Ca2+]i变化测定采用双波长荧光法。结果:大黄脾虚模型大鼠壁细胞胃泌素受体结合位点数有显著降低,经补脾方药治疗后有所恢复;同时脾虚模型壁细胞内静息钙离子浓度明显低于正常组,经胃泌素刺激后壁细胞内[Ca2+]i有所升高,且脾虚模型升高幅度明显高于正常组,经治疗后此状态有所恢复,但无统计学意义。结论:脾虚证可能与胃泌素受体低表达相关,且壁细胞内钙离子处于低代谢状态,但对于胃泌素刺激的反应性增强,进而可能导致酸分泌敏感性相对增高,胃黏膜易损性增强。补脾方药对其有一定的调节作用。

人参皂甙Rb_1降低细胞内Ca^（2＋）作用的机制

使用荧光探针Ｆｕｒａ－２／ＡＭ，采用双波长荧光分光光度法观察到，人参皂甙Ｒｂ＿１（１０，５０，１００μｍｏｌ·Ｌ￣（－１））能剂量依赖性减少新生鼠脑细胞内钙浓度，并能增加由硫酸亚铁及半胱氨酸所降低的膜流动性，Ｒｂ１（１０μｍｏｌ·Ｌ￣（－１））能使离体大鼠尾动脉去甲肾上腺素量一效曲线右移，最大效应降低；Ｒｂ＿１（１０，１００μｍｏｌ·Ｌ￣（－１））能降低离体鼠基底动脉５－ＨＴ所引起的收缩。使用全细胞膜片钳技术发现人参皂甙Ｒｂ＿１（５０，１００μｍｏｌ·Ｌ￣（－１））对钙电流无明显影响；Ｒｂ＿１在低剂量能增加大鼠突触体Ｎａ￣＋－Ｋ￣＋ＡＴＰａｓｅ及Ｃａ￣（２＋）Ｍｇ￣（２＋）ＡＴＰａｓｅ活性。从而揭示Ｒｂ＿１，降低胞内钙含量可能通过增加ＡＴＰ酶活性而产生。

不同浓度中药柴胡提取物对人肝癌细胞内Ca^(2+)和p53表达的影响

目的:测定不同浓度中药柴胡(Bup leurun Ch inese DC,BCDC)提取物对BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)和p53表达的影响,以探索柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制。方法:用Fura-2/AM作为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计测定不同浓度柴胡提取物作用下BEL-7402细胞内[Ca2+]i及其剂量-效应关系;用免疫组化法检测不同条件下BEL-7402细胞的p53表达。结果:柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001),但不具有剂量-效应关系;BEL-7402细胞呈p53天然突变。结论:柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降,为一种钙离子通道阻滞剂(calc ium channel b locker,CCB),提示钙离子通道阻滞作用为柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制之一;BEL-7402细胞呈p53天然突变也可直接或间接影响肿瘤多药耐药性的表达。

二氧化硅和硅酸盐对细胞内游离Ca^（2＋）和Mg^（2＋）浓度的影响

本文研究了不同形态二氧化硅和硅酸盐对细胞内游离Ｃａ（２＋）浓度（［Ｃａ（２＋）］ｉ）及游离Ｍｇ（２＋）浓度（［Ｍｇ（２＋）］ｉ）的影响．结果表明：硅溶胶，聚硅酸．不同硅原子数的固态多硅酸盐及固态二氧化硅都能使［Ｃａ（２＋）］ｉ和［Ｍｇ（２＋）］ｉ升高．硅溶胶的粒径越小，硅酸的聚合度越大，固态多硅酸盐中硅原子数越多，［Ｃａ（２＋）］ｉ和［Ｍａ（２＋）］ｉ升高都越多．不同的晶态二氧化硅使［Ｃａ（２＋）］ｉ和［Ｍｇ（２＋）］ｉ高的顺序为鳞石英＞方石英＞α－石英．

针刺对2型糖尿病患者情绪障碍及糖代谢的干预作用

目的:观察针刺对2型糖尿病患者抑郁、焦虑情绪和糖代谢影响。方法:将100例患者随机分为药物组(口服二甲双胍)、针药组(口服二甲双胍加针刺百会、风府)各50例,测定治疗前后抑郁量表(HAMD、SDS)、焦虑量表(HAMA、SAS)评分及空腹血糖(FPG)、餐后2小时血糖(PG2h)、糖化血红蛋白(GHb)水平。结果:治疗后2组患者情绪障碍均得到改善,FPG、PG2h、GHb水平均下降,针药组优于药物组(P<0.05)。结论:针刺可改善2型糖尿病患者负性心理状态及紊乱的糖代谢,有助于患者血糖的控制。

应用Fura－2／AM和Probenecid测定免疫细胞胞浆游离Ca^（2＋）浓度

人Ｂ细胞系Ｒａｊｉ和ＭΦ系Ｕ９３７细胞可将负载于胞内的Ｃａ￣（２＋）荧光示踪剂Ｆｕｒａ－２外排和房室化，质膜有机阴离子转运系统抑制剂Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ能阻断这些过程，而且对细胞Ｃａ￣（２＋）应答无不良影响。提示Ｒａｊｉ和Ｕ９３７细胞质膜上具有Ｆｕｒａ－２的转运系统；Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ可作为应用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ研究这些细胞Ｇ２￣（２＋）应答的试剂。