青蒿2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因克隆与分析

MEP途径定位于植物细胞的质体中,为包括青蒿素在内的萜类合成提供基本前体。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase,MCT)是该途径的第3个关键酶,催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸生成4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇。本文首次克隆了青蒿MCT基因全长cDNA(AaMCT)并进行了相关生物信息学分析。基因表达结果表明:AaMCT在青蒿分泌型腺体中大量表达,在叶、花、茎和根中少量表达;同时发现,AaMCT表达受到MeJA强烈诱导。亚细胞定位结果显示:AaMCT融合GFP特异性定位在叶绿体中,与MEP途径定位于质体吻合。最后在拟南芥中超量表达AaMCT,拟南芥中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量得到显著提高,表明AaMCT在萜类物质的生物合成中起重要作用。

南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

【目的】克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能。【结果】克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸。TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%。TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体。TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中。TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达。大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累。【结论】不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

以前期获得的银杏(Ginkgo biloba L.)MECT基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到Gb MECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列,研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外,在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆Tw MCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）,以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后0~72 hTwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1 318 bp TwMCT全长c DNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。

芒果MCT基因的鉴定、进化及表达

2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)是MEP代谢途径中关键的酶。为了鉴定芒果中的MCT基因,探索MCT基因的进化路线和表达模式,本研究以拟南芥MCT基因为参考,利用BLAST和HMMER软件,从12个植物基因组中搜索得到了14个MCT基因,对其进行了保守结构域、系统发育分析,并对芒果中MCT基因的表达进行了分析。保守结构域分析结果显示,芒果MCT蛋白包含一个PF01128.19结构域,且蛋白序列高度保守。系统发育分析表明,MCT基因的进化与其所在物种的进化路径保持一致,藻类到被子植物中MCT基因的拷贝数受到严格控制。表达分析结果显示,在芒果品种‘桂热82’和‘红玉’中,MCT基因在发育过程中的芒果果皮、果肉中的表达量高于成熟芒果中果皮、果肉的表达量,推测其在芒果发育过程中有更重要的作用。本研究为进一步阐明芒果MCT基因的功能提供了科学依据。

卷叶贝母MCT基因克隆与表达分析

本研究是基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D. Don)中MEP途径的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, MCT)的开放阅读框(open reading frame, ORF)序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR (qRT-PCR)检测FcMCT基因在野生鳞茎和愈伤组织中的表达情况,为后续卷叶贝母MCT基因功能研究打下基础。通过PCR技术,获得了900 bp的FcMCT ORF片段,编码299个氨基酸,并与NCBI上公布的木薯、橡胶树、向日葵等植物MCT蛋白的相似性达80%以上;通过SOPMA和SWISS-MODE网站预测的Fc MCT蛋白的二级、三级结构,可以看出FcMCT蛋白的主要结构元件是无规卷曲和α螺旋构成;通过qRT-PCR检测野生状态的卷叶贝母中根、茎、叶、鳞茎和诱导状态的愈伤组织中的FcMCT基因表达水平,发现在愈伤组织的表达水平最高。最终,我们认为FcMCT是甾类生物碱合成途径的关键酶,在贝母不同组织中的表达量不同,受激素组合诱导表达,FcMCT是一个具有生物学功能的蛋白质,为利用基因工程手段提高卷叶贝母中生物碱含量提供了理论依据。