南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

【目的】克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能。【结果】克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸。TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%。TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体。TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中。TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达。大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累。【结论】不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

芒果MCT基因的鉴定、进化及表达

2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)是MEP代谢途径中关键的酶。为了鉴定芒果中的MCT基因,探索MCT基因的进化路线和表达模式,本研究以拟南芥MCT基因为参考,利用BLAST和HMMER软件,从12个植物基因组中搜索得到了14个MCT基因,对其进行了保守结构域、系统发育分析,并对芒果中MCT基因的表达进行了分析。保守结构域分析结果显示,芒果MCT蛋白包含一个PF01128.19结构域,且蛋白序列高度保守。系统发育分析表明,MCT基因的进化与其所在物种的进化路径保持一致,藻类到被子植物中MCT基因的拷贝数受到严格控制。表达分析结果显示,在芒果品种‘桂热82’和‘红玉’中,MCT基因在发育过程中的芒果果皮、果肉中的表达量高于成熟芒果中果皮、果肉的表达量,推测其在芒果发育过程中有更重要的作用。本研究为进一步阐明芒果MCT基因的功能提供了科学依据。