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Purification and Characterization of 2-Haloacid Dehalogenase from Marine Bacterium Paracoccus sp. DEH99, Isolated from Marine Sponge Hymeniacidon perlevis 被引量:2
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作者 ZHANG Jinyou XIN Yanjuan +2 位作者 CAO Xupeng XUE Song ZHANG Wei 《Journal of Ocean University of China》 SCIE CAS 2014年第1期91-96,共6页
2-haloacid dehalogenases constitute a group of dehalogenases which are capable of dehalogenating the halogenated organic compounds. So far, the 2-haloacid dehalogenases have been found in many bacteria, but not in Par... 2-haloacid dehalogenases constitute a group of dehalogenases which are capable of dehalogenating the halogenated organic compounds. So far, the 2-haloacid dehalogenases have been found in many bacteria, but not in Paracoccus genus. In the present study, one enzyme 2-haloacid dehalogenase(designated as Deh99), induced by DL-2-chloropropionate(DL-2-CPA), was purified from the marine bacterium Paracoccus sp. DEH99, isolated from marine sponge Hymeniacidon perlevis. The enzyme of Deh99 was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography(Q-Sepharose HP), and Superdex 200 gel filtration chromatography. The molecular weight of Deh99 was estimated to be 25.0 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), and 50.0 kDa natively by gel filtration chromatography. The enzyme of Deh99 stereospecifically dehalogenated L-2-CPA to produce D-lactate, with an apparent Michaelis-Menten constant(Km) value of 0.21 mmol L-1 for L-2-CPA. The optimal pH and temperature for Deh99 activity were 10.0 and 40℃, respectively. The enzyme of Deh99 acted on short-carbon-chain 2-haloacids, with the highest activity towards monochloroacetate. The activity of Deh99 was slightly affected by DTT and EDTA, but strongly inhibited by Cu2+ and Zn2+. The enzyme of Deh99 shows unique substrate specificity and inhibitor sensitivities compared to previously characterized 2-haloacid dehalogenases and is the reported one about purified 2-haloacid dehalogenase isolated from the bacteria of Paracoccus genus. 展开更多
关键词 PARACOCCUS sp 2-haloacid dehalogenasE PURIFICATION MARINE BACTERIUM MARINE SPONGE
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Characterization of the dissociation pathways of dichloromethane and glutathione in dichloromethane dehalogenase
2
作者 Gao Xudan Zhang Huizhu Mei Ye 《南京大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期651-660,共10页
Dichloromethane(DCM)dehalogenase stands as a crucial enzyme implicated in the degradation of methylene chloride across diverse environmental and biological contexts.However,the unbinding pathways of ligands from DCM d... Dichloromethane(DCM)dehalogenase stands as a crucial enzyme implicated in the degradation of methylene chloride across diverse environmental and biological contexts.However,the unbinding pathways of ligands from DCM dehalogenase remain unexplored.In order to gain a deeper understanding of the binding sites and dissociation pathways of dichloromethane(DCM)and glutathione(GSH)from the DCM dehalogenase,random accelerated molecular dynamics(RAMD)simulations were performed,in which DCM and GSH were forced to leave the active site.The protein structure was predicted using Alphafold2,and the conformations of GSH and DCM in the binding pocket were predicted by docking.A long equilibrium simulation was conducted to validate the structure of the complex.The results show that GSH is most commonly observed in three main pathways,one of which is more important than the other two.In addition,DCM was observed to escape along a unique pathway.The key residues and protein helices of each pathway were identified.The results can provide a theoretical foundation for the subsequent dissociation mechanism of DCM dehalogenase. 展开更多
关键词 DCM dehalogenase GSH Alphafold2 RAMD unbinding pathways
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Expanded Bed Recovery of D-2-Chloropropionic Acid Dehalogenase Using TiO2-Densified Cellulose Anion Exchanger
3
作者 雷引林 金志华 +2 位作者 童微星 姚善泾 朱自强 《Chinese Journal of Chemical Engineering》 SCIE EI CAS CSCD 2006年第4X期505-510,共6页
关键词 expanded BED adsorption 2-chloropropionic ACID dehalogenasE CELLULOSE ion EXCHANGE
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Expanded Bed Recovery of D-2-Chloropropionic Acid Dehalogenase Using TiOe-Densified Cellulose Anion Exchanger
4
作者 雷引林 金志华 +2 位作者 童微星 姚善泾 朱自强 《Chinese Journal of Chemical Engineering》 SCIE EI CAS CSCD 2006年第4期505-510,共6页
The TiO2-densified cellulose composite beads were activated by epichlorohydrin and coupled with diethylamine, to function as an anion exchanger for expanded bed chromatography. The adsorbent exhibited a favorable perf... The TiO2-densified cellulose composite beads were activated by epichlorohydrin and coupled with diethylamine, to function as an anion exchanger for expanded bed chromatography. The adsorbent exhibited a favorable performance of expanded bed adsorption for proteins, and therefore was applied to the expanded bed recovery of D-2-chloropropionic acid dehalogenase directly from the unclarified homogenate of Pseudomonas sp. NT21. The binding capacity of the dehalogenase was found to be 8.54U·ml^-1 adsorbent, and two active peaks were eluted respectively at 0.15mol·L^-1 and 0.3mol·L^-1 (NH4)2SO4. The result indicated that the overall enzyme yield was 68%, with a purification factor of 22. In comparison to other recovery processes, the yield of the expanded bed process rises at least 70%, simultaneously saving a great deal of operation time and costs. 展开更多
关键词 expanded bed adsorption 2-chloropropionic acid dehalogenasE CELLULOSE ion exchange
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(S)-2-氯丙酸脱卤酶发酵条件优化
5
作者 项炯华 王海琪 +2 位作者 刘明 吴坚平 杨立荣 《广东化工》 CAS 2009年第8期45-46,74,共3页
以对(S)-2-氯丙酸有高效脱卤能力的菌株S4为研究对象,对其发酵产酶条件进行了研究。研究了各种碳源、氮源对产酶的影响,确定培养基组成为:葡萄糖10g/L,尿素0.5g/L,Na2HPO4·12H2O3.2g/L,KH2PO41.5g/L,MgSO40.098g/L。摇瓶培养优化... 以对(S)-2-氯丙酸有高效脱卤能力的菌株S4为研究对象,对其发酵产酶条件进行了研究。研究了各种碳源、氮源对产酶的影响,确定培养基组成为:葡萄糖10g/L,尿素0.5g/L,Na2HPO4·12H2O3.2g/L,KH2PO41.5g/L,MgSO40.098g/L。摇瓶培养优化后条件为:接种量5%,培养基初始pH7.0,培养温度30℃,摇床转速180r/min,装液量20%。 展开更多
关键词 (S)-2-氯丙酸 脱卤酶 发酵条件
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R-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化 被引量:1
6
作者 秦迎春 刘鹏 +2 位作者 杨立荣 徐刚 吴坚平 《生物加工过程》 CAS CSCD 2013年第1期65-69,共5页
通过易错PCR手段将R-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并使用基于Cl-浓度显色反应的高通量筛选得到有效突变子库,发现突变子DehDIV-G2和DehDIV-E7的酶比活力分别提高25.2%和38.7%。通过SYBYL对酶与底物进行分子对接显示,DehDIV-G2的活化能下降0.... 通过易错PCR手段将R-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并使用基于Cl-浓度显色反应的高通量筛选得到有效突变子库,发现突变子DehDIV-G2和DehDIV-E7的酶比活力分别提高25.2%和38.7%。通过SYBYL对酶与底物进行分子对接显示,DehDIV-G2的活化能下降0.961 4 kJ/mol,DehDIV-E7的活化能下降2.549 8 kJ/mol。由于酶和底物R-2-氯丙酸的活化能下降,亲和能力提高,从而提高酶的比活力。 展开更多
关键词 2-氯丙酸 脱卤酶 定向进化 分子对接
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R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究 被引量:2
7
作者 林春娇 杨立荣 +1 位作者 徐刚 吴坚平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期191-198,共8页
对来自假单胞菌ZJU26中的R-2-卤代酸脱卤酶(DehI-R)进行同源模建,分析其与底物的相互作用,为解析酶的底物对映体选择性提供理论依据。采用Sybyl中的APM模块首次构建并优化了R-2-卤代酸脱卤酶的三维结构,并用Procheck验证结构模型的合理... 对来自假单胞菌ZJU26中的R-2-卤代酸脱卤酶(DehI-R)进行同源模建,分析其与底物的相互作用,为解析酶的底物对映体选择性提供理论依据。采用Sybyl中的APM模块首次构建并优化了R-2-卤代酸脱卤酶的三维结构,并用Procheck验证结构模型的合理性。使用Surflex-Docking模块将结构模型与底物分别进行对接,分析相互之间的作用。序列比对结果显示,R-2-卤代酸脱卤酶与恶臭假单胞菌PP3中DehI的相似性达23.71%。Deh-R模建后的结构与模板很好的吻合。模型比对分析DehI-R中参与催化的残基,除Asn203外大部分都比较保守。分子对接结果表明,R-2-氯丙酸和S-2-氯丙酸都可以结合到活性位点上,决定其选择性的是位点Asn203,在RS-2-卤代酸脱卤酶所对应位点的残基为Ala,相比之下,Asn具备较大的空间位阻,从而阻止了S-2-氯丙酸的反应。利用Sybyl中的Biopolymer模块对R-2-卤代酸脱卤酶中的Asn203突变成具有不同空间位阻的Ala、Gly和Gln。突变酶与底物对接结果进一步证实了Asn203位点对R-2-卤代酸脱卤酶的底物对映体选择性作用。 展开更多
关键词 R-2-卤代酸脱卤酶 同源模建 分子对接 假单胞菌ZJU26 对映体选择性
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Characteristics of dehalogenase from bacteria isolated from the Gut of Pond-reared Rohu (<i>Labeo rohita</i>) Juveniles in Myanmar
8
作者 Eleanor Abel Rolando V. Pakingking Jr. +2 位作者 Gregoria Gregoria May Thanda Wint Fahrul Huyop 《Advances in Bioscience and Biotechnology》 2012年第4期353-361,共9页
Unwarranted accumulation of halogenated compounds in the rivers and streams has in recent years emerged due to the widespread use agricultural pesticides. The presence of these halogenated compounds in the water does ... Unwarranted accumulation of halogenated compounds in the rivers and streams has in recent years emerged due to the widespread use agricultural pesticides. The presence of these halogenated compounds in the water does not only suppress the immune system of fish but adversely induce serious morbidity and mortality among cultured stocks. Importantly, gradual accumulation of these compounds in the system of cultured and wild freshwater fish species cultured in ponds and floating net-cages in dams and rivers, respectively, poses some risks to humans, the end users. In this study, we attempted to isolate bacteria from the gut of pond-reared rohu (Labeo rohita) in Myanmar, screened the isolated bacteria for dehalogenase gene using molecular technique and tested the ability of these bacteria to degrade halogenated compounds in vitro. The eight bacterial strains studied were identified as Enterobacter mori strain MK- 121001, Enterobacter cloacae strains MK121003, MK-121004, MK121010, Ralstonia solanacearum strain 121002, Acinetobacter baumannii strain MK121007, Chromobacterium violaceum strain MK121009 and Pantoea vagans strain 121011. Only three bacterial strains (MK121002, MK121007 and MK121009) were capable of degrading 2,2-dichloropropionic acid (2,2-DCP) as the sole carbon source up to a final substrate concentration of 20 mM. Their mean growth doubling time ranging from 6-23 hours with the maximum of chloride ion released of 85%. PCR amplifica- tion with oligonucleotide primers designed from group I dehalogenase revealed the presence of deha- logenase genes in all isolates suggesting dehalogenase gene in strains 121001, 121003, 121004, 121010 and 121011 were silenced. In contrast, group II dehalogenase primers did not show any PCR amplification. These results suggest that MK121002, MK121007 and MK121009 only encode a group I dehalogenase and its non-stereoselectivity is in agreement with previoulsly described group I haloacid dehalogenase. The partial gene sequences were blasted but no significant sequence identity was observed. Therefore, it suggest the 2-haloacid dehalogenase of MK121002, MK12-1007 and MK121009 might be a novel group I 2-haloacid dehalogenase. The results indicated a broad distribution of dehalogenation genes in many micro- bial genomes that harbor dehalogenase(s) due to the exposure of the microorganisms to the naturally occurring or man-made halogenated compounds in the environmental systems. So far, microorganisms capable of producing dehalogenases were mainly isolated from soil and scarcely from aquatic animals and their environments. To the authors’ knowledge, this is the first report on the isolation of dehalogenase-producing bacteria from the gut of pond-reared freshwater fish, Labeo rohita, in Myanmar. 展开更多
关键词 2 2-Dichloropropionic ACID 16S rDNA Labeo rohita dehalogenasE Gene Biodegradation Haloalkanoic ACID Dichloropropionate
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2-卤代酸脱卤酶的表达优化
9
作者 王亚月 董超群 +2 位作者 靳志远 张萌萌 裴冬丽 《商丘师范学院学报》 CAS 2022年第9期46-49,共4页
2-卤代酸脱卤酶是催化2-卤代酸脱卤产生相应2-羟基酸的一类酶,其水解脱卤能力和对映体选择性使其在环境修复与光学纯手性化合物绿色合成领域具有广阔应用前景.然而天然2-卤代酸脱卤酶产量通常很低,本文以分离自Pseudomonas putida PP3... 2-卤代酸脱卤酶是催化2-卤代酸脱卤产生相应2-羟基酸的一类酶,其水解脱卤能力和对映体选择性使其在环境修复与光学纯手性化合物绿色合成领域具有广阔应用前景.然而天然2-卤代酸脱卤酶产量通常很低,本文以分离自Pseudomonas putida PP3菌株的DL-2-卤代酸脱卤酶DehI为研究对象,构建DehI-pET28a重组质粒,在大肠杆菌中进行原核表达,并对其表达条件进行优化.经优化获得其最佳表达条件:当细胞OD_(600)nm为0.8,IPTG为0.2 mM,30℃诱导9 h时,活性蛋白量最高,为1.36 U/mL,与常用诱导条件相比提高7.5倍.本研究为2-卤代酸脱卤酶构效关系及其改造研究奠定基础. 展开更多
关键词 2-卤代酸脱卤酶 异源表达 优化
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卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的工艺优化
10
作者 亚香菊 王于齐 +4 位作者 朱鑫海 经玉洁 林茜 薛锋 高健 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第8期3823-3828,共6页
以卤醇脱卤酶重组湿菌体E. coli BL21(pET28a-HHDH)为催化剂,催化外消旋的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的动力学拆分可以获得光学纯的(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。本文系统地研究了卤醇脱卤酶催化合成光学纯(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的影响因素... 以卤醇脱卤酶重组湿菌体E. coli BL21(pET28a-HHDH)为催化剂,催化外消旋的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的动力学拆分可以获得光学纯的(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。本文系统地研究了卤醇脱卤酶催化合成光学纯(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的影响因素,对反应pH、反应温度、菌体浓度、亲核试剂N3-浓度和底物浓度进行了探究。结果表明,卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的最佳工艺条件为:pH为7.0,反应温度为28℃,菌体浓度为22.5g/L,亲核试剂NaN3的浓度为50mmol/L,底物外消旋1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的浓度为10mmol/L。在此工艺条件下,(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的ee值和收率分别为100%和16.97%。 展开更多
关键词 卤醇脱卤酶 1-氯-3-苯氧基-2-丙醇 催化 工艺
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卤醇脱卤酶催化合成(S)-2-溴-1-苯基乙醇的工艺优化
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作者 童琦 吴少玉 +3 位作者 杨晶晶 经玉洁 林茜 薛锋 《化学与生物工程》 CAS 2019年第12期33-37,55,共6页
以新型卤醇脱卤酶AbHHDH为催化剂,催化拆分外消旋2-溴-1-苯基乙醇生成光学纯的(S)-2-溴-1-苯基乙醇,通过单因素实验探究了缓冲液pH值、缓冲液浓度、催化剂用量、底物浓度以及温度对催化合成反应的影响。结果表明,在NaH2PO4-Na2HPO4缓冲... 以新型卤醇脱卤酶AbHHDH为催化剂,催化拆分外消旋2-溴-1-苯基乙醇生成光学纯的(S)-2-溴-1-苯基乙醇,通过单因素实验探究了缓冲液pH值、缓冲液浓度、催化剂用量、底物浓度以及温度对催化合成反应的影响。结果表明,在NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液pH值为8.0、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液浓度为200 mmol·L^-1、催化剂用量为37.5 g·L^-1、底物浓度为20 mmol·L^-1、温度为28℃的最优工艺条件下反应15 min,(S)-2-溴-1-苯基乙醇的ee值为100%,收率为35.11%。 展开更多
关键词 2-溴-1-苯基乙醇 卤醇脱卤酶 生物催化 手性
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嗜热古细菌Sulfolobus tokodaii脱卤酶在D-乳酸生产中的应用 被引量:4
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作者 解桂秋 潘东 +2 位作者 何文龙 高贵 高仁钧 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2015年第4期698-703,共6页
将来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的脱卤酶(L-HADST)基因克隆到载体p ET28b,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在蛋白的N末端带有6个组氨酸融合标签,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示融合蛋白的分子量约为25000.融合蛋白催化2-氯丙酸(2... 将来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的脱卤酶(L-HADST)基因克隆到载体p ET28b,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在蛋白的N末端带有6个组氨酸融合标签,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示融合蛋白的分子量约为25000.融合蛋白催化2-氯丙酸(2-CPA)的最适反应温度为70℃,最适p H值为9.5.以外消旋2-CPA为底物生产D-乳酸,利用HPLC检测反应液中2-CPA及乳酸的变化,发现L-HADST只催化L-2-CPA脱氯反应.对酶催化反应条件进行了优化,结果表明,在p H值为9.5,温度为60℃的条件下,当反应体系中缓冲液浓度为3 mol/L,底物浓度为0.5 mol/L,酶浓度为3×104U/L时有较高的底物转化率及乳酸生成量.依据条件优化结果可知,影响反应速度的因素有底物浓度、缓冲液浓度以及酶浓度,其中底物浓度变化对转换率的影响最明显. 展开更多
关键词 L-2-卤代酸脱卤酶 2-氯丙酸 乳酸
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烷基卤脱卤酶作用机制的研究新进展 被引量:1
13
作者 张玉花 陈德展 《山东化工》 CAS 2009年第12期20-23,27,共5页
烷基卤脱卤酶的催化脱卤反应具有重要的合成价值和治理环境污染方面的巨大潜力。随着酶晶体结构的确定,它的催化作用机制逐渐被研究。目前,催化循环机制在很多方面仍然存有争议。本文对烷基卤脱卤酶催化脱卤机制的研究新进展进行了综述... 烷基卤脱卤酶的催化脱卤反应具有重要的合成价值和治理环境污染方面的巨大潜力。随着酶晶体结构的确定,它的催化作用机制逐渐被研究。目前,催化循环机制在很多方面仍然存有争议。本文对烷基卤脱卤酶催化脱卤机制的研究新进展进行了综述,以期对脱卤机制进行进一步研究,不断提高酶的生物催化活性和拓宽底物范围,为工业上生物催化难降解有机卤化物提供理论依据。 展开更多
关键词 烷基卤脱卤酶 1.2-二氯乙烷 脱卤 生物降解
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甘油原料转化生产手性环氧氯丙烷关键酶的开发 被引量:3
14
作者 张晓健 郑裕国 《生物产业技术》 2017年第6期65-72,共8页
手性环氧氯丙烷是一种重要的三碳手性合成子,在医药、农药、化工、材料等领域有着广泛的应用。开发以甘油替代石油基原料合成手性环氧氯丙烷的绿色合成工艺具有重要的开发价值。生物催化技术可有效提高过程安全性与原子经济性,降低"... 手性环氧氯丙烷是一种重要的三碳手性合成子,在医药、农药、化工、材料等领域有着广泛的应用。开发以甘油替代石油基原料合成手性环氧氯丙烷的绿色合成工艺具有重要的开发价值。生物催化技术可有效提高过程安全性与原子经济性,降低"三废"排放,提升产品质量。阐述了生物催化合成手性环氧氯丙烷关键酶技术的研究进展,进行了生物合成路线设计、卤化酶酶库构建、卤醇脱卤酶与环氧化物水解酶的筛选与改造、卤醇脱卤酶/环氧化物水解酶双酶串联合成手性环氧氯丙烷工艺构建等技术开发,为手性环氧氯丙烷绿色生物合成技术的研究与应用提供理论基础与技术支持。 展开更多
关键词 甘油 手性环氧氯丙烷 1 3-二氯-2-丙醇 生物催化 卤醇脱卤酶 环氧化物水解酶
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产脱卤酶菌株的筛选及其应用
15
作者 曹京雯 郑国钧 《化学与生物工程》 CAS 2010年第9期61-65,共5页
以氯乙酸作为唯一碳源,从土壤样本中筛选获得了高产脱卤酶菌株17#,具有将β-溴对硝基苯乙醇转化为对硝基环氧苯乙烯的活性,优化了发酵培养基和转化条件。确定最适培养基组成(g.L-1)为:乳糖8,胰蛋白6,氯乙酸4,Na2HPO43.2,KH2PO41.5,MgSO4... 以氯乙酸作为唯一碳源,从土壤样本中筛选获得了高产脱卤酶菌株17#,具有将β-溴对硝基苯乙醇转化为对硝基环氧苯乙烯的活性,优化了发酵培养基和转化条件。确定最适培养基组成(g.L-1)为:乳糖8,胰蛋白6,氯乙酸4,Na2HPO43.2,KH2PO41.5,MgSO498 mg,CaCl210 mg,FeSO41 mg,ZnSO40.1 mg,pH值6.50;最适培养条件为30℃培养35 h。最佳转化条件为35℃下转化β-溴对硝基苯乙醇12 h。菌株17#在最适培养条件下,酶活力达到最高值132.80 U.mg-1,在最佳转化条件下的转化率为90.6%。菌株17#可以高效地将β-溴对硝基苯乙醇转化为对硝基环氧苯乙烯。 展开更多
关键词 脱卤酶 β-溴对硝基苯乙醇 对硝基环氧苯乙烯 菌株 筛选
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酿酒酵母对特定底物脱卤机制的研究
16
作者 焦安浩 张松 《齐鲁工业大学学报》 CAS 2014年第2期40-42,共3页
酿酒酵母能够还原2-氯乙酰乙酸乙酯中的顺式和反式的羰基酯。在手性的还原过程中能够进行脱卤的酶对乙酰乙酸乙酯的还原竞争性由细胞质中的谷胱甘肽进行调节。脱氯是由谷胱甘肽体系中尚未确定的谷胱甘肽产生的脱卤酶催化的。第一步反应... 酿酒酵母能够还原2-氯乙酰乙酸乙酯中的顺式和反式的羰基酯。在手性的还原过程中能够进行脱卤的酶对乙酰乙酸乙酯的还原竞争性由细胞质中的谷胱甘肽进行调节。脱氯是由谷胱甘肽体系中尚未确定的谷胱甘肽产生的脱卤酶催化的。第一步反应是谷胱甘肽亲和取代来取代氯原子,然后另一个谷胱甘肽产生脱卤酶来催化硫醚键的断裂。是两个电子转移到细胞质中形成谷胱甘肽氧化物。这个反应是由真菌在有氧的情况下催化完成的,也是一个由谷胱甘肽介导的微生物还原脱卤的例子。 展开更多
关键词 酿酒酵母 2-氯乙酰乙酸乙酯 谷胱甘肽 脱卤酶
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Structure-guided protein design of fluoroacetate dehalogenase for kinetic resolution of rac-2-bromobutyric acid
17
作者 Shu Wang Zhanbing Cheng +4 位作者 Yanbing Xu Lu Yang Jian-Bo Wang Zhenhua Tian Xudong Qu 《Green Synthesis and Catalysis》 2020年第1期60-65,共6页
R-2-Bromobutyric acid is a very important intermediate for the synthesis of agrochemicals and pharmaceuticals.Bioresolution of rac-2-bromobutyric acid(rac-2-BBA)provides a promising process for R-2-bromobutyric acid(R... R-2-Bromobutyric acid is a very important intermediate for the synthesis of agrochemicals and pharmaceuticals.Bioresolution of rac-2-bromobutyric acid(rac-2-BBA)provides a promising process for R-2-bromobutyric acid(R-2-BBA)production.The fluoroacetate dehalogenase(FAcD)has been always studied in the defluorination process.We found that FAcD RPA1163 showed detectable activity but no enantioselectivity towards rac-2-BBA.The iterative saturation mutagenesis(ISM)of FAcD RPA1163 resulted in a mutant H155V/W156R/Y219M,which catalyzed the kinetic resolution of rac-2-BBA to produce R-2-BBA with enhanced activity and enantioselectivity(99.3%ee).The high preference for S-2-bromobutyric acid(S-2-BBA)is of synthetic value.Molecular docking analysis indicated that the H155V/W156R/Y219M mutation reduced steric hindrance and broadened the halide pocket.It is not only the steric hindrance but also the electrostatic environment that has an effect on the activity and enantioselectivity. 展开更多
关键词 Fluoroacetate dehalogenase Semi-rational design Enzyme engineering Kinetic resolution 2-bromobutyric acid
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S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用 被引量:4
18
作者 刘鹏 林春娇 +2 位作者 杨立荣 徐刚 吴坚平 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期66-72,共7页
为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进... 为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。 展开更多
关键词 2-氯丙酸 脱卤酶 定向进化 分子对接
原文传递
S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达 被引量:1
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作者 秦迎春 杨立荣 +1 位作者 徐刚 吴坚平 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期24-30,共7页
根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。... 根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。 展开更多
关键词 S-2-氯丙酸脱卤酶 毕赤酵母 胞外活性表达 高拷贝
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来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶的手性识别过程研究 被引量:1
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作者 张滢潭 杨立荣 +1 位作者 徐刚 吴坚平 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期16-22,共7页
立体选择性是2-卤代酸脱卤酶最重要的性质之一,但目前其手性识别过程尚不明确,对其进行研究和解析具有重要意义。以来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶dehDIV-R为模型,研究了R-2-卤代酸脱卤酶的手性识别过程。首先通过测定反应产物的... 立体选择性是2-卤代酸脱卤酶最重要的性质之一,但目前其手性识别过程尚不明确,对其进行研究和解析具有重要意义。以来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶dehDIV-R为模型,研究了R-2-卤代酸脱卤酶的手性识别过程。首先通过测定反应产物的构型,确定dehDIV-R催化底物为SN2反应。通过Discovery Studio 3.0对dehDIV-R进行同源模建及底物分子对接,由对接结果和序列比对确定dehDIV-R立体选择性的关键位点Asn236,预测dehDIV-R的立体选择性与反应时底物到达反应位置的空间位阻密切相关。对dehDIV-R进行虚拟突变,将Asn236位点突变成具有不同空间位阻的残基Ala和Ser,并分别与底物分子进行分子对接,预测突变酶的立体选择性。根据预测结果,对Asn236氨基酸残基进行定点突变,发现在Asn236突变为Ala后的A1酶显示出对RS底物的活力;在Asn236突变为Ser后的S1酶显示出与原始酶相反的立体选择性,实现了立体选择性的反转。与模型的预测结果相符,证明了模型的合理性。 展开更多
关键词 2-氯丙酸脱卤酶 手性识别过程 分子对接
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