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鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达 被引量:2
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作者 李雪梅 章金刚 +3 位作者 向华 陈晓月 金宁一 费恩阁 《生物技术通讯》 CAS 2002年第5期331-333,共3页
根据国外已发表的鹅细小病毒(GPV)A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白(VP2-VP3)基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株(GPVCC株)的VP2-VP3基因。将扩增的目的基因插入到原核表达载体pET28(a... 根据国外已发表的鹅细小病毒(GPV)A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白(VP2-VP3)基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株(GPVCC株)的VP2-VP3基因。将扩增的目的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPVVP2-VP3基因的原核载体pEGVP1。重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75000和58000的表达蛋白带。Westernblot分析表明,表达产物具有很好的特异性。 展开更多
关键词 鹅细小病毒 长春分离株 结构蛋白 (VP2-vp3) 原核表达 基因表达
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鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序 被引量:4
2
作者 刘佳琪 高帅 +7 位作者 段可馨 郭梦婷 杜航 康海燕 张英 唐立杰 李一经 刘敏 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期622-627,共6页
为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗... 为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗粒饲料,口服免疫虹鳟幼鱼。免疫程序分为连续免疫组、免疫1 d后间隔1 d再免疫1 d组、连续免疫4 d后32 d加强免疫1次组和间隔免疫后32 d加强免疫1次组。免疫后进行尾动脉采血,间接ELISA方法检测各组血清抗体效价,免疫接种66 d后,腹腔注射IPNV,计算各组相对免疫保护率。确定颗粒饲料按照1 mL/g比例与108 CFU/mL重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212和2.5%海藻酸钠混合,于20℃烘干制备口服疫苗。间隔免疫组血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于其他组,并且免疫2次的间隔免疫组的血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于免疫1次间隔免疫组。采用重组菌包被颗粒饲料饲喂虹鳟幼鱼,间隔免疫的免疫程序和免疫保护率优于连续免疫的免疫程序,对IPNV的入侵起到保护作用。 展开更多
关键词 虹鳟 植物乳杆菌 IPNV VP2-vp3 口服疫苗 免疫程序
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辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析
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作者 刘琪 刘正伟 +4 位作者 梁琳 张利 郝春晖 李玥 赵福庆 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期23-32,共10页
【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪... 【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪便的病毒DNA进行FPV VP2基因PCR扩增及测序,使用Seqman软件对序列进行拼接。将所获序列与NCBI数据库中FPV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的VP2基因进行相似性比对及遗传进化分析。使用生物信息学软件对该毒株VP2蛋白进行预测,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、糖基化位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构等。【结果】FPV LN3株VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;与GenBank上登录的15株FPV同属一个大分支,相似性为98.9%~99.7%;与CPV处于不同分支上。生物信息学软件预测显示,FPV LN3株VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;含有7个潜在N-糖基化位点、86个O-糖基化位点和50个磷酸化位点;VP2蛋白在细胞质、细胞核、线粒体中的可能性分别为43.5%、34.8%和21.7%;VP2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角分别占61.82%、8.90%、24.32%及4.97%,三级结构预测结果与其一致;VP2蛋白共有20个抗原表位。【结论】VP2是FPV遗传变异的关键基因,FPV LN3株VP2蛋白属于亲水性、非跨膜稳定蛋白,共存在20个抗原表位。试验结果为进一步研究FPV VP2蛋白功能及研发新型疫苗提供理论依据。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒 VP2基因 生物信息学 蛋白结构
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《庄子·内篇》“VP_(1)而VP_(2)”“NP之VP”结构研究
4
作者 黄昌杰 《现代语文》 2024年第1期45-50,共6页
连词“而”是一个高频虚词,当它连接两个动词性词语VP_(1)、VP_(2)时,用法较为复杂。根据两个VP之间的句法语义关系,《庄子·内篇》中的“VP_(1)而VP_(2)”结构可以分析为四种类型:连谓、偏正、联合、紧缩。“NP之VP”结构在《内篇... 连词“而”是一个高频虚词,当它连接两个动词性词语VP_(1)、VP_(2)时,用法较为复杂。根据两个VP之间的句法语义关系,《庄子·内篇》中的“VP_(1)而VP_(2)”结构可以分析为四种类型:连谓、偏正、联合、紧缩。“NP之VP”结构在《内篇》中的出现频率也比较高。结构助词“之”置于主谓结构“NP+VP”中间,形成体词性偏正结构“NP之VP”,相当于现代汉语“NP的VP”。该结构在句法上只能分布于主、宾位;在语义上不具有独立性,是谓语核心动词的论元成分;在语用上具有指称功能。 展开更多
关键词 《庄子·内篇》 “VP_(1)而VP_(2)” “NP之VP” 连词 “而” 结构助词 “之”
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传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用 被引量:1
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作者 王威威 刘婷 +7 位作者 陈果 姬忠华 赵增志 黄宇 陈艳艳 石梦雅 何秀苗 韦平 《畜牧与兽医》 北大核心 2020年第5期73-80,共8页
为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基... 为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。 展开更多
关键词 IBDV VP2基因 VP1基因 VP2-vp1串联基因 原核表达
原文传递
抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立
6
作者 王慧娟 谷淑燕 +2 位作者 张素香 周为民 皮国华 《生物技术通讯》 CAS 2002年第6期451-452,共2页
制备抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体,用于检测人血清中的B19抗原,辅助诊断相关疾病;也可用于制备人类细小病毒基因工程疫苗。用纯化的基因工程表达的B19-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法... 制备抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体,用于检测人血清中的B19抗原,辅助诊断相关疾病;也可用于制备人类细小病毒基因工程疫苗。用纯化的基因工程表达的B19-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA及IF证明抗体特异性。克隆筛选出4株细胞,并初步建立了检测B19-VP2抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验,为双抗体夹心法检测B19抗原为临床相关疾病诊断提供了检测手段。 展开更多
关键词 细小病毒B19-vp2 单克隆抗体 基因工程B19-vp2蛋白 酶联免疫吸附试验
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猫细小病毒洛阳分离株VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备 被引量:1
7
作者 王文婕 茹鹏辉 +5 位作者 郁川 杜付熙 陈松彪 尚珂 张春杰 程相朝 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1511-1521,共11页
【目的】研究旨在对猫细小病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)洛阳分离株VP2蛋白进行原核表达和鼠源多克隆抗体制备。【方法】根据已公布的FPV VP 2基因序列(GenBank登录号:EU018143.1)设计1对特异性引物,以洛阳地区7例疑似FPV感染... 【目的】研究旨在对猫细小病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)洛阳分离株VP2蛋白进行原核表达和鼠源多克隆抗体制备。【方法】根据已公布的FPV VP 2基因序列(GenBank登录号:EU018143.1)设计1对特异性引物,以洛阳地区7例疑似FPV感染猫粪便为样本提取DNA,对VP 2基因进行PCR鉴定及测序,利用Mega 11.0软件对VP 2基因进行遗传进化分析;应用在线软件预测分离株VP2蛋白结构特征并找出优势抗原表位,克隆VP2优势抗原(sVP2)并连接pET-32a(+)载体,构建pET-32a-sVP2重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行诱导表达,对重组蛋白表达条件进行优化,并使用SDS-PAGE与Western blotting方法进行鉴定;将pET-32a-sVP2用镍柱亲和层析蛋白纯化后免疫BABL/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。【结果】分离得到1株FPV,命名为LY-1。遗传进化分析发现,该毒株属于FPV-G2亚群,与北京株(GenBank登录号:MT270581)亲缘关系最近。生物信息学分析显示,VP2属于稳定膜内蛋白,无信号肽与跨膜区,在N-端具有丰富的B细胞抗原表位(1―800 bp,sVP2)。试验成功构建pET-32a-sVP2重组质粒并表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约50 ku,主要以包涵体形式存在,在30℃、1 mmol/L IPTG诱导6 h蛋白表达量最佳;Western blotting结果表明,重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明,该重组蛋白抗体效价为1∶128000,能够较好地识别免疫原sVP2和原核表达VP2蛋白并发生特异性反应。【结论】本试验克隆获得FPV sVP2片段,并制备多克隆抗体,为进一步研究VP2在FPV复制和致病过程中的作用及建立诊断FPV方法提供参考。 展开更多
关键词 猫细小病毒(FPV) 洛阳分离株 VP 2基因 原核表达 多克隆抗体
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引起细胞病变的甲肝病毒BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因序列的测定 被引量:1
8
作者 洪世雯 沈宏辉 鞠连才 《传染病信息》 2000年第2期63-64,共2页
目的测定我室分离的甲型肝炎病毒(HAV)BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因区的核苷酸序列。方法从BJ-1感染的A549细胞中提取病毒RNA模板,通过RT-PCR扩增相应的cDNA片段,测定其核苷酸序列。结果BJ-1株与野型株MBB比较,VP4-VP2区有4个核苷酸变异,... 目的测定我室分离的甲型肝炎病毒(HAV)BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因区的核苷酸序列。方法从BJ-1感染的A549细胞中提取病毒RNA模板,通过RT-PCR扩增相应的cDNA片段,测定其核苷酸序列。结果BJ-1株与野型株MBB比较,VP4-VP2区有4个核苷酸变异,同源性为99.5%(731/735),推论的氨基酸序列有1个氨基酸变异,同源性为99.6%(244/245)。与HM-175比较,有30个核苷酸变异,同源性为95.9%(705/735),推论的氨基酸序列均相同,同源性为100%。结论核苷酸序列分析结果初步确定BJ-1株属甲型肝炎病毒。 展开更多
关键词 甲型肝炎 HAV-BJ-1株 VP4-vp2基因 序列分析
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聚2-乙烯基吡啶/聚苯乙烯互穿聚合物网络双电荷膜的合成 被引量:1
9
作者 李玉玮 王静媛 +1 位作者 栗宜明 汤心颐 《吉林大学自然科学学报》 CAS CSCD 1991年第3期77-80,共4页
通过分步光聚合法制备聚2-乙烯基吡啶/聚苯乙烯(P(2-VP)/PS)IPN膜,采用苯环磺化和吡啶环季胺化分别引入正负双电荷,经过电镜、动态力学性能及交换容量的测试表明,所合成的双电荷IPN膜是双相连续并对Na^+及Cl^-有一定交换容量。
关键词 P(2-vp)/PS IPN 双电荷膜 膜科学
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传染性法氏囊病毒VP_2在酵母细胞内的高效表达及其免疫原性研究 被引量:8
10
作者 王笑梅 王牟平 +3 位作者 高宏雷 付朝阳 曾祥伟 张守发 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期443-447,共5页
应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好... 应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好的载体pPICVP2 用SacI内切酶线性化后 ,转染酵母PichiapastorisGS115细胞 ,经PCR鉴定 ,筛选出 5 0多个重组子。分别用甲醇诱导后 ,经SDS PAGE凝胶电泳、琼脂扩散试验、Dot ELISA检测 ,得到 9个不同程度表达 4 1kuVP2 活性蛋白的阳性重组子。经凝胶薄层扫描仪分析 ,表达蛋白占酵母细胞总蛋白的最高比率为 16 % ,表达量为 0 .6 2 0 8g·L-1。表达产物免疫SPF鸡可诱导产生特异性抗体 ,并能保护鸡抵抗超强毒致死性攻击 ,具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒VP2 酵母细胞 基因表达 免疫原性 特异性抗体 传染性法氏囊病
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不同肥水处理对茄子新品种绿玉1号和绿玉2号生长发育、产量及品质的影响 被引量:7
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作者 米国全 程志芳 +4 位作者 王晋华 赵肖斌 韩永平 李小红 李继淑 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2015年第8期104-107,共4页
为探索茄子新品种绿玉1号和绿玉2号最佳的肥水管理配套栽培模式,采用3水平有机肥施肥量(300 m3/hm2、150 m3/hm2和75 m3/hm2)和2水平灌水量(7 d和10 d灌水1次)处理,研究了不同肥水处理对茄子生长发育、产量及品质的影响。结果表明:绿玉... 为探索茄子新品种绿玉1号和绿玉2号最佳的肥水管理配套栽培模式,采用3水平有机肥施肥量(300 m3/hm2、150 m3/hm2和75 m3/hm2)和2水平灌水量(7 d和10 d灌水1次)处理,研究了不同肥水处理对茄子生长发育、产量及品质的影响。结果表明:绿玉1号茄子在150 m3/hm2施肥量下,结果早期采用10 d灌水1次,结果盛期采用7 d灌水1次,早期产量、总产量、维生素P(Vp)含量和维生素C(Vc)含量均较高。而绿玉2号茄子在300 m3/hm2和7 d灌水1次情况下,早期产量和Vp含量均较高,总产量和Vc含量均最高。从经济角度来说,2个茄子品种采用150 m3/hm2施肥量,结果期采用7 d灌水1次是最经济、环境友好、节水的肥水管理模式。 展开更多
关键词 茄子新品种 绿玉1号 绿玉2 产量 维生素P
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猪细小病毒VP_2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性 被引量:11
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作者 吕建强 陈焕春 +2 位作者 赵俊龙 肖少波 王革非 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期675-679,共5页
将猪细小病毒 (PorcineParvovirus,PPV)vp2 基因重组到杆状病毒Bac To Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中 ,构建了pFast vp2 质粒。在DH10 Bac大肠杆菌中 ,pFast vp2 与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)基因组 (Bacmid)发生同源重... 将猪细小病毒 (PorcineParvovirus,PPV)vp2 基因重组到杆状病毒Bac To Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中 ,构建了pFast vp2 质粒。在DH10 Bac大肠杆菌中 ,pFast vp2 与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)基因组 (Bacmid)发生同源重组 ,从而获得重组穿梭载体Bac mid vp2 ,转染Sf9细胞得到重组病毒AcNPV vp2 。SDS PAGE和Western blotting分析可见大小约为 6 4kD的特异性带 ,表明AcNPV vp2 在Sf9细胞中成功地表达了PPVVP2 蛋白。红细胞凝集试验和间接ELISA进一步证实 ,表达的VP2 蛋白具有与全病毒相同的血凝活性和相似的抗原性。电镜观察VP2 蛋白的粗提物 ,发现VP2 蛋白可自行装配成许多病毒样粒子 (VLPs) 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白 昆虫细胞 表达 病毒样粒子
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IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析 被引量:2
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作者 杨霞 周欣 +3 位作者 赵军 姚惠霞 王川庆 王泽霖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期928-936,共9页
为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Ver... 为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒(IBDV) 培养特性 致病性 VP2基因高变区 VP5
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番鸭细小病毒强、弱毒株VP2基因的序列测定比较 被引量:6
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作者 娄华 白挨泉 +3 位作者 顾万军 贺东生 杨德威 刘福安 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期175-179,共5页
According to the complete nucleotide sequence of Muscovy duck parvovirus registered in the gene bank, two modified primers (LHMP7/LHMP8) were designed and, for each of them, a restriction endonuclease recognition site... According to the complete nucleotide sequence of Muscovy duck parvovirus registered in the gene bank, two modified primers (LHMP7/LHMP8) were designed and, for each of them, a restriction endonuclease recognition site, SacⅡ or KpnⅠ, was included respectively. The DNA encoding VP2 structural protein of the wild strain MDPV Q and the attenuated strain MDPV 26 which had been derived by continued passage of virulent wild type (MDPV Q) in Muscovy duck embryo were amplified by PCR and recombined into T vector and sequenced respectively. It shows that both DNA encoding VP 2 structural protein of MDPV Q and MDPV which has been registered in the gene bank had the high homology (97.9%). MDPV 26 and MDPV Q displayed 99.7% identity, and shared 98.3% homology with that of reported MDPV. 展开更多
关键词 番鸭细小病毒 VP2基因克隆 序列测定
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犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化 被引量:8
15
作者 龙丹丹 嵇辛勤 +5 位作者 段志强 阮涌 陈强 雷云 万彪 胡焱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第3期643-649,共7页
为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3... 为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 755bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。 展开更多
关键词 犬细小病毒(CPV) VP2基因 原核表达 纯化
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虎源猫瘟热病毒VP2蛋白基因在毕赤酵母中的表达 被引量:5
16
作者 杨松涛 夏咸柱 +7 位作者 乔军 王铁成 郑明光 常爽 黄耕 苏建青 冯娜 王化磊 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期29-32,共4页
克隆了虎源猫瘟热病毒VP 2蛋白基因并首次在Pichia pastoris酵母中进行了分泌表达。用特异性引物从虎源FPV中扩增出VP 2基因,将其克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pTVP 2进行测序。用EcoR I和NotI双酶切pTVP 2,回收目的基因VP 2片段将... 克隆了虎源猫瘟热病毒VP 2蛋白基因并首次在Pichia pastoris酵母中进行了分泌表达。用特异性引物从虎源FPV中扩增出VP 2基因,将其克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pTVP 2进行测序。用EcoR I和NotI双酶切pTVP 2,回收目的基因VP 2片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAVP 2。将pPICZαAVP 2用SacI内切酶线性化后,电转化毕赤酵母细胞GS115,PCR法筛选阳性重组酵母,并用1%甲醇诱导表达。结果在重组酵母菌培养物上清中经SDS-PAGE检测到相对分子量约为32 kD的重组蛋白,W estern-b lotting证实该重组蛋白可以与FPV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明重组VP 2蛋白具有正确的空间构象,有望作为虎FPV感染的诊断和免疫预防用抗原。 展开更多
关键词 猫瘟热病毒 VP2蛋白基因 毕赤酵母 表达
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传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP_2基因的克隆及序列分析 被引量:3
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作者 宋秀龙 李春梅 +3 位作者 王笑梅 陈冠春 陈奖励 王秀荣 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期223-226,共4页
根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .... 根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3~ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 超强毒株 基因克隆 序列分析
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传染性法氏囊病病毒X毒株不同代次的致病性及VP_2可变区序列分析 被引量:4
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作者 刘伯华 李健强 +3 位作者 刘湘涛 韩雪清 薛登民 赵启祖 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期1-5,共5页
分别以传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) X毒株细胞适应的第 5代、第 1 1代和第 1 7代毒感染 38日龄非免疫雏鸡进行致病性试验 ,确定 X毒株的毒力 ,并比较 3个代次毒的致病性差异 ,进而利用 RT-PCR扩增其VP2 基因可变区 ,测定其核苷酸序列 ,... 分别以传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) X毒株细胞适应的第 5代、第 1 1代和第 1 7代毒感染 38日龄非免疫雏鸡进行致病性试验 ,确定 X毒株的毒力 ,并比较 3个代次毒的致病性差异 ,进而利用 RT-PCR扩增其VP2 基因可变区 ,测定其核苷酸序列 ,从分子生态学角度研究了非鸡胚源细胞传代培养对 IBDV X毒株毒力和抗原性的影响。结果表明 ,IBDV X毒株表现为中等毒力 ,在 Vero细胞上传代后 ,其毒力有所减弱。VP2 可变区氨基酸序列有 3个位置发生了替换 ,即第 5代毒氨基酸残基 2 62位为半胱氨酸 ,而第 1 1代毒和第 1 7代毒则变为酪氨酸 ( Cys→ Tyr) ;第 5代毒的 2 90位为缬氨酸 ,而第 1 1代和第 1 7代毒则变为蛋氨酸 ( Val→Met) ;第 5代毒和第 1 1代毒的 31 6位为赖氨酸 ,而第 1 7代毒则变为精氨酸 ( Lys→Arg)。 2 90位氨基酸替换导致该区域二级结构的改变 ,并对 IBDV的抗原性有显著影响。上述结果提示 ,这些氨基酸残基可能对维持IBDV的毒力和抗原性是必要的。通过毒株间 VP2 可变区序列的比较和系统发生树的分析 ,证明 IBDV X毒株与 Bursin-2疫苗毒关系很近。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 X毒株 致病性 VP2可变区 序列分析
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蓝舌病毒内蒙古分离株VP_2基因3′端序列的克隆及序列分析 被引量:1
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作者 李充璧 方天祺 +2 位作者 王升启 程建国 刘小强 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 1999年第6期755-757,共3页
内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病毒株(BTV-NM)经反转录PCR,克隆、测序、进行计算机分析,证明该部分序列与呼肠孤病毒3 型L3 基因组片段有高度同源性,达91% ,与BTV 17VP2 基因比较,一致性为47%
关键词 蓝舌病毒 VP2基因序列 克隆 家畜 呼肠孤病毒科
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IBDV细胞适应株的驯化及其VP2基因的分子特征分析 被引量:1
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作者 王洁琼 赵玉杰 +4 位作者 周薇帆 周云飞 陈田田 刘建勋 李新生 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2018年第8期1-8,共8页
【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死... 【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50);通过SPF鸡胚-CEF-DF-1途径对X1进行驯化,使其适应永生细胞DF-1;根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV分离株和细胞适应株的VP2基因并测序,将其与参考毒株进行同源性和进化树分析,同时对二者在VP2高变区及七肽区的推导氨基酸序列进行对比分析。【结果】IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的ELD_(50)为10-8 mL^(-1),经驯化获得了细胞适应株C1。对2株病毒的VP2基因进行克隆并鉴定,测序分析得IBDV X1株在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S4个特征性氨基酸,与IBDV超强毒株(vvIBDV)HK46 VP2基因氨基酸序列的同源性高达99.3%,确定X1株为IBDV超强毒株。同源性及进化树分析结果显示,C1株与IBDV减毒株CEF94亲缘关系较近,同源性较高,为99.6%,确定C1株为IBDV减毒株。在VP2高变区及七肽区推导氨基酸比对中显示,C1株第330位精氨酸R取代了X1株在330位的丝氨酸S;第222位氨基酸由A变成P;决定病毒毒力的位点第256和284位分别由I、A变为V和T。【结论】成功驯化了1株vvIBDV使其适应细胞,初步揭示vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化的过程中,VP2高变区及七肽区氨基酸序列有明显变化。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒 VP2基因 基因克隆 序列分析
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