2.2.15细胞上清HBVDNA定量检测方法的比较

目的拟筛选和比较2.2.15细胞上清中HBVDNA定量检测的方法。方法分别采用3种方法抽提HBVDNA,抽提物分别采用Taqman荧光定量、SYBR荧光定量PCR技术检测其滴度。结果直接应用上清分别采取热变性,碱裂解法抽提HBVDNA均为阴性,而应用PEG沉淀后检测结果证实细胞上清中有高拷贝的分泌性HBVDNA,Taqman荧光定量方法的敏感性高于SYBR实时定量PCR,在高拷贝时,两种方法的检测结果一致。结论PEG沉淀法是2.2.15细胞上清HBVDNA提取的有效方法,Taqman荧光定量方法敏感性高,是HBVDNA定量检查的首选方法。SYBR法简便,经济,也可用于上清HBVDNA的检测。

HepG2．2．15细胞培养上清液中HBVDNA及其抗原的检测

乙型肝炎病毒（HBV）是一种引起急性和慢性坏死炎症性肝病及肝细胞癌的DNA病毒。HBV具有特异嗜肝性、非细胞损伤与裂解、易发展为慢性等特征。HepG2．2．15细胞是能够表达HBV抗原和分泌完整HBV颗粒的肝胚瘤细胞系，也是目前用来研究HBV复制．肝细胞对干扰素（IFN）应答最为合适的细胞模型系统。

CuSO_4对2.2.15细胞的影响

目的:探讨硫酸铜(CuSO4)对2.2.15细胞代谢及HBV复制和表达的影响及其机制. 方法:采用MTT法检测CuSO4对2.2.15细胞的毒性,流式细胞仪检测细胞周期.透射电镜法,Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪观察CuSO4对2.2.15细胞凋亡的影响,采用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测不同浓度的CuSO4作用后2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的P/N 值.Taq man荧光定量PCR检测不同浓度CuSO4作用后上清中HBVDNA滴度. 结果:MTT实验确定CuSO4在培养液中对2.2.15细胞的最大无毒剂量是128μmol/L.CuSO4作用后可引起细胞周期的改变,肝癌细胞被阻滞在G2+M期,且呈量效相关性.但是未发现CuSO4有诱导凋亡的作用,CuSO4干预12 d的结果显示2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的滴度及HBVDNA 的复制水平与对照组无明显差别. 结论:CuSO4有明显的细胞毒作用,可引起肿瘤细胞周期的改变及细胞坏死,提示了铜的抗癌作用的分子机制,CuSO4 短期处理2.2.15细胞后暂未发现其对HBV复制和表达的影响.

HepG2.2.15细胞株中乙型肝炎病毒基因异质性的研究

目的以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因异质性来探讨在HepG2.2.15细胞体内是否存在HBV准种。方法依据Genebank中HBVayw亚型全基因序列,选择保守区域设计出特异性多聚酶链反应引物,自HepG2.2.15细胞培养上清中扩增HBV前C/C基因序列,克隆入pGEM-TEasy载体,挑选15个克隆测序以比较病毒的变异程度。结果测序结果发现HepG2.2.15细胞HBV前C/C基因存在异质性,碱基序列之间的同源性大于93%,突变类型全部为碱基替换。结论结果提示,长期培养HepG2.2.15细胞内有HBV准种共存,这种细胞模型内HBV异质性现象可能影响其在基因治疗等方面的应用。

HBs／CD3双特异性抗体介导LAK对HBVDNA转染细胞的细胞毒作用

双持异性抗体已应用于导向LAK细胞杀伤胃癌细胞、肝癌细胞、人免疫缺陷病毒(HIV)感染细胞，是继单克隆抗体之后又一重大进展。本研究应用化学偶联方法合成HBs/CD3双特异性抗体，并观察其对LAK细胞的细胞毒性怍用影响。用化学偶联剂SPDP将鼠源的CD3与HBs单克隆抗体连接得到HBs／CD3双特异性抗体。以LAK细胞为效应细胞，HBV DNA转染的2.2.15细胞为靶细胞。设HepG-2和K562细胞为对照组。实验显示，HBs／CD3双特异性单克窿抗体能显著提高LAK细胞与2．2．15细胞结合率；应用^125I-UdR释放试验检铡细胞毒性发现双特异性抗体能增强LAK细胞对2.2.15细胞的细胞毒性并且与抗体浓度相关，BsAb浓度递增．细胞毒性作用随之增加．对细胞毒性作用的特异性研究表明．加入HBs／CD3BsAb后。LAK细胞对2.2.15细胞毒性显著高于HepG-2和K562细胞组。上述结果表明。HBs／CD3双特异性抗体具有双向识别LAK细胞和2．2．15细胞特性。特异地促进LAK细胞与靶细胞结合，发挥选择性细胞毒性作用．

干扰素作用下乙型肝炎病毒的变异机制

目的:体外研究干扰素-α2b(IFN-α2b)作用下乙肝病毒(HBV)突变机制. 方法:以不同浓度IFN-α2b反复作用于HBV分泌型HepG2.2.15细胞,Western blot方法检测培养细胞上清中AFP,提取培养细胞上清中HBV基因组DNA,以聚合酶联反应扩增HBV C基因,克隆入pGEM-T easy 载体,鉴定后行测序分析. 结果:Western blot方法检测各组培养细胞上清中AFP, 实验组AFP未见明显减少;序列分析表明,对照组前C/ C基因克隆有两种类型,同源性93%,有10个氨基酸的差别,其中6个氨基酸相比,氨基酸的性质相同; 实验组同样具有这两种克隆,其中优势株所占比例分别为12/15、14/14和9/15,高剂量组与对照组相比优势株所占比例差异有统计学意义(P<0.05);实验组高剂量IFN 组出现了四个插入/缺失突变克隆,造成前C/C基因移框突变,其中C31-2插入突变发生在前C区,另外3个突变均发生在C区,与优势株相比平均同源性97%以上. 结论:在rhIFN-α高剂量条件选择下,能检测到HepG2. 2.15HBV前C/C基因插入或缺失突变株,突变株与优势株相比基因序列同源性平均在97%以上.

乙型肝炎病毒L02细胞转染模型的建立与鉴定

我们以L02细胞为基础,利用基因重组技术构建含1.3倍加长乙型肝炎病毒(HBV)全基因组的表达质粒pcDNA-HBV,进行基因转染,获得了类似HepG2 2.2.15(简称2.2.15细胞)(HepG2转染HBV DNA后所得)具有复制和分泌HBV能力的HBV转染细胞模型.

RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSuper-C,观察其对HepG2 2.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。 方法 根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对HBV核心区的相应序列,再将其克隆人含聚合酶ⅢH 1-RNA启动子的真核表达载体pSuper,将此重组质粒以电转染法转入2.2.1 5细胞中,用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。 结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper-C;但以电穿孔法转染2.2.15细胞后未能发现其对2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。 结论 RNAi在2.2.1 5细胞中的作用还需进一步的实验来证实。

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法 以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果 成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论 获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。