RNA干扰20S蛋白酶体α亚基基因对莱茵衣藻油脂代谢的影响

为了解20S蛋白酶体α亚基(20S proteasome alpha subunit A,POA1)基因对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂代谢的调控,对莱茵衣藻CC425在低氮胁迫下的CrPOA1表达进行了分析,克隆POA1同源基因片段,构建pMaa7IR/XIR干涉载体并转化莱茵衣藻CC425,对CrPOA1进行有效沉默,测定转基因藻株细胞干质量和油脂含量;克隆全长基因,构建CrPOA1-GFP融合表达载体并转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位。结果表明,莱茵衣藻在低氮培养下,CrPOA1 mRNA水平比对照(正常培养)显著降低(P<0.01),RNAi转基因藻株CrPOA1 mRNA水平比对照pMaa7IR/XIR(maa7)降低79.36%~85.35%,沉默效果较好;RNAi转基因藻株细胞干质量与对照maa7无显著差异,油脂含量比对照maa7显著降低6.38%~24.63%,CrPOA1正向调控莱茵衣藻油脂;亚细胞定位于细胞核。这表明CrPOA1参与了莱茵衣藻的油脂代谢过程。

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。

蛋白酶体20S亚基β8调控丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶通路对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究蛋白酶体20S亚基β8(PSMB8)对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过调控丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路发挥其作用。方法采用癌症基因组图谱数据库分析ccRCC与正常组织PSMB8 mRNA的表达水平,并通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色等方法进一步检测PSMB8在ccRCC组织和细胞中的表达情况。构建稳定过表达和敲减PSMB8的细胞株,分别采用CCK-8法和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭的能力。对PSMB8共表达基因进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析,Western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白的磷酸化水平,并加用ERK激动剂C16-PAF处理进行细胞功能学挽救实验。结果与正常组织比较,PSMB8 mRNA和蛋白在ccRCC组织中呈高表达(P均<0.001),且与临床患者的TNM分期显著相关(P<0.001);与阴性对照组比较,过表达PSMB8可以促进786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.021,P=0.039)、迁移和侵袭(P均<0.001),敲减PSMB8可以抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.022,P=0.005)、迁移和侵袭(P均<0.001);PSMB8共表达基因通路富集分析提示其可能与丝裂原活化蛋白激酶通路相关(P<0.001);敲减PSMB8后786-O和ACHN细胞MEK1/2(P=0.017,P=0.016)、ERK1/2(P=0.010,P=0.040)蛋白磷酸化水平及ERK下游因子c-Myc(P=0.043,P=0.038)、c-Fos(P=0.025,P=0.008)和CyclinD1(P=0.006,P=0.047)转录水平均下调;与ERK激动剂C16-PAF处理组比较,敲减PSMB8+C16-PAF组明显抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.003,P=0.002)、迁移和侵袭能力(P均<0.001)。结论PSMB8通过激活MEK/ERK信号通路从而促进ccRCC细胞的增殖、迁移及侵袭。

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织20s蛋白酶体C_2亚基的基因及蛋白表达的研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子——泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达水平及意义。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定大鼠伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达。结果 RT-PCR结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达(IOD值)较对照组增加,差异有统计学意义(P<0.01);Westernblot结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达较对照组增强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 COPD大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达均显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一。

水稻杂种超亲表达26S蛋白酶体亚基基因OsHL1的克隆和分析

运用DDRT PCR分离获得水稻杂种一代超亲表达的cDNA片段。以此序列在日本晴cDNA全长数据库进行同源搜索 ,检索到一个功能未知的全长cDNA ,有 16 90bp,命名为OsHL1,进一步分析发现它位于 3号染色体上R2 393和MRG4 5 4 8之间。序列分析表明 ,该基因与日本晴编码 2 6Sproteasomeregulatoryparticlenon ATPasesubunit5基因片段的序列同源性为97%。其中包含一个完整的开放阅读框 (ORF) ,编码 4 4 3个氨基酸 ,氨基酸序列同源性分析发现高度保守区。RT PCR显示OsHL1基因的表达受到ABA和MeJA处理下调。推测杂种的表现可能与 2 6S蛋白酶体亚基参与的信号调控相关。

20S蛋白酶体表达与类风湿关节炎的关系探讨

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者20S蛋白酶体表达水平的变化及其与RA疾病活动性的关系。方法测定RA患者及正常对照外周血单个核细胞20S蛋白酶体蛋白表达水平。结果与正常对照相比,RA患者20S蛋白酶体表达升高[(2.92±1.41VS(0.65±0.42),P<0.01]。20S蛋白酶体表达水平与DAS28、CRP、ERS之间无显著相关性。结论 RA患者PBMC中20S蛋白酶体表达升高,其水平与疾病活动无显著相关性。

人肝癌细胞氧化应激模型中热休克蛋白90α对20S蛋白酶体功能的影响

目的观察人肝癌细胞氧化应激模型中细胞内Hsp90α和20S蛋白酶体的表达的变化以及Hsp90α表达下调后对20S蛋白酶体功能的影响;明确热休克蛋白90α对20s蛋白酶体功能的影响。方法以500μMH2O2建立氧化应激HepG2细胞模型;通过ROS探针法观察细胞在不同氧化应激条件下ROS的分布和含量,通过MTT比色法观察氧化应激对细胞存活的影响;以免疫印迹方法检测氧化应激对细胞内Hsp90α及20S蛋白酶体的合成的影响;以pSilencer2.1-U6neo载体,用电穿孔法建立稳定的Hsp90α抑制表达细胞株,通过检测糜蛋白酶活性观察氧化应激和降低Hsp90α表达对蛋白酶体活性的影响。结果氧化应激后细胞内ROS的含量增多,且分布从胞浆向胞核转移;随着作用时间延长,H2O2对HepG2细胞增殖的抑制程度增强;氧化应激导致胞内Hsp90α表达量先增加后降低,20S蛋白酶体表达量明显降低;siRNA干扰组蛋白酶体活性显著下降。结论氧化应激可影响细胞内Hsp90α和20S蛋白酶体的表达并改变其细胞内分布;氧化应激及降低Hsp90α的表达均可影响蛋白酶体的活性;Hsp90α对蛋白酶体功能维持起保护性的作用。

慢性阻塞性肺疾病患者血清泛素、20S蛋白酶体的变化及意义

目的:检测慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清泛素(Ub)、20S蛋白酶体(20SPSM)的变化,并探讨其与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的相关性。方法:采用酶联免疫吸附测定法检测30例COPD急性加重期患者(COPDⅠ组)、30例COPD缓解期患者(COPDⅡ组)及30例健康体检者(正常对照组)血清Ub、20SPSM、TNF-α水平,并进行分析。结果:与正常对照组及COPDⅡ组比较,COPDⅠ组血清Ub、20SPSM、TNF-α均显著增加(P<0.01)。与正常对照组比较,COPDⅡ组血清Ub、TNF-α显著增加(P<0.01),20SPSM增加不显著(P>0.05)。COPD患者血清Ub、20SPSM水平分别与TNF-α具有相关性(r=0.559,r=0.859,均P<0.01)。结论:Ub、20SPSM在COPD患者血清中含量增加,可能与COPD患者体内蛋白质高分解代谢相关,并且其水平增加与COPD全身炎症反应因子TNF-α激活相关。

大鼠脾脏20S蛋白酶体的分离纯化及电镜观察

目的 分离纯化正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并观察其形态特征。方法 采用分级盐析、离子交换层析及凝胶过滤方法 ,分离纯化了正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并进行透射电镜观察。结果 所制备的2 0S蛋白酶体纯度较高 ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 1条带 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示 8条带 ,分子量为 ( 19.8～ 31.7)× 10 3;电镜观察显示 ,脾脏 2 0S蛋白酶体呈现典型的圆筒状 ,具有同其它细胞 2 0S蛋白酶体一样的形态特征。结论 这为进一研究 2 0S蛋白酶体结构与功能的关系奠定了基础。

合浦珠母贝26S蛋白酶体S4,S7亚基基因片段的分离与分析

26S蛋白酶体是真核生物中一种具有ATP依赖性的蛋白酶复合体 ,主要通过泛肽途径选择性降解细胞内与代谢调控、细胞周期有关的功能蛋白及异常蛋白 ,参与多种细胞活动的调控过程。26S蛋白酶体由具有催化活性的20S亚复合体和一个具有调节作用的19S亚复合体组成 ,其中19S亚复合体中的ATP酶亚基是调节26S蛋白酶体活性的重要组件。本文通过简并引物PCR手段 ,从软体动物合浦珠母贝(Pinctadafucata)中扩增到参与构成19S亚复合体的S4和S7(MSS1)两个亚基的基因片段。这两个基因片段所编码的ATP酶组件包含有Gx4GKT,DEID ,SAT和H/QRxGRxxR等26S蛋白酶体ATP酶亚基的共同功能基序。这是首次在软体动物中报道26S蛋白酶体的ATP酶亚基基因序列 。

20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的：应用基因沉默技术,观察下调20S蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖能力的影响及其潜在机制,寻求调节干细胞活力的关键靶点.方法：构建PSMB5-shRNA慢病毒载体感染早期hBMSCs,根据感染条件不同将细胞分为绿色荧光蛋白（GFP）对照组和shRNA组.倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫印迹检测PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性;BrdU掺入实验观察PSMB5基因沉默对早期hBMSCs增殖潜能的影响,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹检测细胞周期相关蛋白1（cyclin D1）及其激酶CDK4的表达变化.结果：慢病毒感染早期hBMSCs 72 h可见约95％以上细胞表达绿色荧光蛋白.shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平较GFP对照组分别降低93.31％＆#177;0.59％和56.83％＆#177;13.31％,且蛋白酶体活性较对照组降低37.47％＆#177;0.41％.此外,shRNA组BrdU阳性率26.14％＆#177;8.13％较对照组49.53％＆#177;11.18％显著降低,G1期细胞较GFP对照组增多,而S期和G2/M期细胞却较对照组减少,Cyclin D1和CDK4的表达水平分别下降54.55％＆#177;7.76％和63.26％＆#177;15.76％.结论：PSMB5基因沉默能够下调Cyclin D1和CDK4的表达,导致细胞G1/S转换停滞,影响hBMSCs增殖潜能.

刺参26S蛋白酶体S7亚基基因的克隆与组织表达分析

应用RACE法从刺参Apostichopus japonicus体腔细胞中克隆出26S蛋白酶体组成19S亚复合体亚基之一的S7亚基基因(GenBank登录号:JQ922514)。该基因的cDNA序列全长为2 445 bp,其中5’UTR为70bp,3’UTR为1 070 bp,开放阅读框为1 305 bp,编码435个氨基酸;保守区具有典型的ATP结合和水解基序,氨基酸序列分别为GPPGTGKT和DEID,具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺参26S蛋白酶体S7亚基基因与紫海胆的氨基酸序列同源性最高(95%),与脊椎动物、节肢动物的同源性较高(88%~89%),与线虫、拟南芥和酵母同源性较低(85%、77%和73%);S7亚基编码的蛋白没有信号肽,也没有跨膜结构域,为非跨膜蛋白,定位于细胞中的液态基质中。采用实时定量PCR方法检测了26S蛋白酶体S7亚基基因在刺参5种组织中的表达情况,结果显示,在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中26S蛋白酶体S7基因均有明显表达,且体腔细胞中表达量最高,其次是纵肌和肠,在体壁和呼吸树中表达量较低。本研究中首次在刺参体内发现并克隆了26S蛋白酶体S7亚基基因,同时采用Realtime PCR技术对该基因的表达部位进行了研究,所得结果将为研究棘皮动物蛋白质代谢途径提供新的着眼点,为刺参生理功能的调控研究奠定了基础。

针对20S蛋白酶体的抗肿瘤药物研究进展

20S蛋白酶体在生物体内的功能主要是水解蛋白,其与许多疾病如阿尔斯海默症、癌症等有密切的相关性,已经成为抗肿瘤药物研发的新靶点。本文对已经上市的硼替佐米、卡非佐米及正在临床研究阶段的Marizomib的结构及应用特点进行综述。

20S蛋白酶体β5亚单位对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响.方法:体外分离培养新生BALB/c小鼠(P0)的NSCs,应用免疫荧光染色观察PSMB5在NSCs中的表达与分布;利用real time RT-PCR方法检测PSMB5 mRNA的表达;荧光分光光度法测定PSMB5相关的糜蛋白酶活性的变化;应用PSMB5-siRNA抑制P0 NSCs中PSMB5基因的表达;使用含有PSMB5基因的重组慢病毒((lenti-PSMB5))感染成年小鼠(P90)NSCs.利用CCK-8试验检测PSMB5对NSCs增殖能力的影响,利用BrdU和Tuj1染色观察PSMB5基因敲低和过表达对NSCs增殖及分化能力的影响.结果:PSMB5主要分布于NSCs的胞浆,P0的NSCs分化后,PSMB5 mRNA的表达下调.成年和老年小鼠NSCs中糜蛋白酶体活性较新生小鼠显著降低.PSMB5敲减后NSCs增殖能力和向神经元分化能力减弱,PSMB5过表达后NSCs增殖能力和向神经元分化能力增强.结论:PSMB5可能参与小鼠NSCs增殖及分化的调控.

中国地鼠26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13的表达鉴定及生物信息学分析

目的鉴定26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13(PSMD13)在Ⅱ型糖尿病中国地鼠的表达及对其理化性质、信号肽、亚细胞定位、功能结构域等进行分析,为深入研究其功能提供理论依据。方法荧光定量PCR法检测PSMD13 mRNA在中国地鼠和糖尿病地鼠肝、骨骼肌、脂肪和小肠组织的表达;PSMD13氨基酸序列从NCBI网站下载,氨基酸同源性分析采用DNAman软件;PSMD13蛋白的理化性质分析采用Prot Param在线工具;PSMD13蛋白的亲疏水性、信号肽、亚细胞定位采用Prot Scale软件分析;PSMD13蛋白结构域、二级结构分别采用Conserved Domain数据库和SOPMA工具分析;PSMD13蛋白质的互作蛋白及功能网络采用STRING数据库分析。结果RT-qPCR结果显示PSMD13 mRNA在糖尿病地鼠脂肪组织中表达下降;PSMD13位于中国地鼠第3号染色体,含有13个外显子,相对分子质量为42942.48,含有378个氨基酸残基;PSMD13理论等电点为6.1,属酸性蛋白;其与小鼠、大鼠、果蝇、猩猩和人PSMD13的氨基酸序列同源性高达97.78%;PSMD13蛋白质无信号肽、无跨膜结构,主要位于细胞质中;PSMD13蛋白质羧基端含有一个PCI结构域,与PSMD7、PSMD8、PSMA3、PSMC1和USP14等相互作用,参与泛素依赖性蛋白质分解代谢过程。结论PSMD13在糖尿病中国地鼠脂肪组织中表达下降,该蛋白质在进化上高度保守,参与蛋白质的蛋白酶体降解途径,其表达下调可能参与糖尿病的发生发展。

高氧导致20S蛋白酶体活性降低诱导早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡

目的建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)原代培养高氧细胞损伤模型,研究高氧对泛素化蛋白的降解及AECⅡ凋亡的影响。方法早产大鼠原代AECⅡ体外培养,利用950 m L/L O2建立高氧细胞损伤模型并随机分为空气组和高氧组。空气或高氧暴露24、48、72 h后,采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR检测泛素mRNA表达,Western blot法检测细胞内总泛素化蛋白及凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达,利用特异性荧光底物检测20S蛋白酶体活性。结果与同时间点空气组相比,各时间点高氧组AECⅡ凋亡增加,AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素mRNA和总泛素化蛋白表达增加,同时Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达明显上调。结论高氧暴露引起AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素化蛋白降解减少,通过上调Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达诱导AECⅡ凋亡。

20S蛋白酶体与动脉粥样硬化关系的试验研究

目的 探讨20S蛋白酶体及蛋白酶体α亚单位在人动脉粥样硬化斑块中的表达变化,以及与动脉粥样硬化病变之间的关联.方法 搜集病例组（颈动脉粥样硬化狭窄并行颈动脉内膜切除术患者）及对照组（主动脉夹层并行主动脉置换术患者）的相关临床资料.选择病例组中7例术中所切除的颈动脉粥样硬化斑块组织,以及对照组中7例术中所切除的相对正常的锁骨下动脉及无名动脉组织,采用Western印迹方法,检测并比较其中的20S蛋白酶体及蛋白酶体α亚单位的蛋白质水平.结果 ①病例组和对照组各7例,病例组的高脂血症、糖尿病及吸烟比率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;②蛋白酶体所有α亚基（1-7）在正常动脉内膜、动脉粥样斑块组织中的表达差异无统计学意义（P均＞0.05）;③20S蛋白酶体在动脉粥样斑块组织中的表达水平明显低于对照组（P＜0.05）.结论 20S蛋白酶体可能在动脉粥样硬化斑块的病理变化过程中起着重要的作用,而蛋白酶体α亚单位在其中的作用有待进一步探讨.

26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13基因多态性与强直性脊柱炎的关系

目的探讨26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13(PSMD13)基因多态性与强直性脊柱炎(AS)的关系。方法选择20例AS患者为AS组,20例健康体检者为对照组。采集所有研究对象的血液样本并提取DNA,扩增PSMD13基因rs1045288、rs28927679、rs1794108、rs1794109位点的DNA片段,分析两组间PSMD13基因不同位点等位基因和基因型分布频率。结果所有位点的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡定律。两组间PSMD13基因rs1045288位点的等位基因和基因型分布频率,以及rs28927679位点的等位基因分布频率比较,差异均有统计学意义(均P <0. 05);而两组PSMD13基因rs1794108位点和rs1794109位点的等位基因和基因型分布频率比较,差异均无统计学意义(均P> 0. 05)。结论 PSMD13基因rs1045288位点和rs28927679位点的多态性可能与AS发生相关。

20S蛋白酶体抑制剂的药理作用研究进展

蛋白酶体可通过调节蛋白质降解来介导蛋白质稳态,因此在许多重要细胞活动中起关键调节作用,目前主要是癌症治疗的作用靶点。随着蛋白酶体抑制剂不断地被开发,其在其他疾病的治疗中也展现出巨大的潜力。本文主要对蛋白酶体抑制剂的药理作用进行了综述,以期为蛋白酶体抑制剂进一步被利用提供一定参考价值。

锰对PC12细胞增殖及蛋白酶体活性的抑制作用

目的:探讨锰对PC12细胞蛋白酶体20s复合物活性的影响。方法:以MTT以及平板克隆形成实验筛选作用浓度,不同时间以及不同浓度作用之后,提取细胞总蛋白,分别检测总蛋白提取液中20s复合物3种酶的活性。结果:含有MnCl2300μmol/L的培养基对蛋白酶体3种酶活性的抑制率随着作用时间的延长而增高。作用3 d后,对3种酶活性的抑制率均超过20%。在作用时间相同的条件下,随着作用浓度的增高,锰对PC12细胞蛋白酶体活性的抑制作用逐渐增强。同样作用3 d后,当MnCl2浓度达到500μmol/L时,锰对3种酶活性的抑制率均超过40%。结论:蛋白酶体20s活性的抑制可能在锰所诱导的神经毒性过程中发挥着一定的作用。