20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的：应用基因沉默技术,观察下调20S蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖能力的影响及其潜在机制,寻求调节干细胞活力的关键靶点.方法：构建PSMB5-shRNA慢病毒载体感染早期hBMSCs,根据感染条件不同将细胞分为绿色荧光蛋白（GFP）对照组和shRNA组.倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫印迹检测PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性;BrdU掺入实验观察PSMB5基因沉默对早期hBMSCs增殖潜能的影响,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹检测细胞周期相关蛋白1（cyclin D1）及其激酶CDK4的表达变化.结果：慢病毒感染早期hBMSCs 72 h可见约95％以上细胞表达绿色荧光蛋白.shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平较GFP对照组分别降低93.31％＆#177;0.59％和56.83％＆#177;13.31％,且蛋白酶体活性较对照组降低37.47％＆#177;0.41％.此外,shRNA组BrdU阳性率26.14％＆#177;8.13％较对照组49.53％＆#177;11.18％显著降低,G1期细胞较GFP对照组增多,而S期和G2/M期细胞却较对照组减少,Cyclin D1和CDK4的表达水平分别下降54.55％＆#177;7.76％和63.26％＆#177;15.76％.结论：PSMB5基因沉默能够下调Cyclin D1和CDK4的表达,导致细胞G1/S转换停滞,影响hBMSCs增殖潜能.

20S蛋白酶体β5亚单位对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响.方法:体外分离培养新生BALB/c小鼠(P0)的NSCs,应用免疫荧光染色观察PSMB5在NSCs中的表达与分布;利用real time RT-PCR方法检测PSMB5 mRNA的表达;荧光分光光度法测定PSMB5相关的糜蛋白酶活性的变化;应用PSMB5-siRNA抑制P0 NSCs中PSMB5基因的表达;使用含有PSMB5基因的重组慢病毒((lenti-PSMB5))感染成年小鼠(P90)NSCs.利用CCK-8试验检测PSMB5对NSCs增殖能力的影响,利用BrdU和Tuj1染色观察PSMB5基因敲低和过表达对NSCs增殖及分化能力的影响.结果:PSMB5主要分布于NSCs的胞浆,P0的NSCs分化后,PSMB5 mRNA的表达下调.成年和老年小鼠NSCs中糜蛋白酶体活性较新生小鼠显著降低.PSMB5敲减后NSCs增殖能力和向神经元分化能力减弱,PSMB5过表达后NSCs增殖能力和向神经元分化能力增强.结论:PSMB5可能参与小鼠NSCs增殖及分化的调控.

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。

蛋白酶体β5亚单位基因真核表达载体的构建

目的:构建蛋白酶体亚单位β5基因真核表达质粒。方法:从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得β5亚单位的全长cDNA片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。结果:RT-PCR法扩增出约792bp的β5亚单位基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的β5亚单位的基因序列完全正确。结论:成功构建了蛋白酶体β5亚单位基因真核表达重组质粒。

RNA干扰20S蛋白酶体α亚基基因对莱茵衣藻油脂代谢的影响

为了解20S蛋白酶体α亚基(20S proteasome alpha subunit A,POA1)基因对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂代谢的调控,对莱茵衣藻CC425在低氮胁迫下的CrPOA1表达进行了分析,克隆POA1同源基因片段,构建pMaa7IR/XIR干涉载体并转化莱茵衣藻CC425,对CrPOA1进行有效沉默,测定转基因藻株细胞干质量和油脂含量;克隆全长基因,构建CrPOA1-GFP融合表达载体并转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位。结果表明,莱茵衣藻在低氮培养下,CrPOA1 mRNA水平比对照(正常培养)显著降低(P<0.01),RNAi转基因藻株CrPOA1 mRNA水平比对照pMaa7IR/XIR(maa7)降低79.36%~85.35%,沉默效果较好;RNAi转基因藻株细胞干质量与对照maa7无显著差异,油脂含量比对照maa7显著降低6.38%~24.63%,CrPOA1正向调控莱茵衣藻油脂;亚细胞定位于细胞核。这表明CrPOA1参与了莱茵衣藻的油脂代谢过程。

山西汉族高血压人群与蛋白酶体α_6亚单位基因多态性的相关性研究

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin—proleasome pathway．UPP）是Hershko等发现的一种高效蛋白降解途径，主要负责真核细胞内蛋白的选择性降解，由泛素、泛素活化酶、泛素偶联酶、泛素一蛋白连接酶、26S蛋白酶体以及泛素再循环酶等组成。该途径参与体内许多重要的生理功能，

20S蛋白酶体与动脉粥样硬化关系的试验研究

目的 探讨20S蛋白酶体及蛋白酶体α亚单位在人动脉粥样硬化斑块中的表达变化,以及与动脉粥样硬化病变之间的关联.方法 搜集病例组（颈动脉粥样硬化狭窄并行颈动脉内膜切除术患者）及对照组（主动脉夹层并行主动脉置换术患者）的相关临床资料.选择病例组中7例术中所切除的颈动脉粥样硬化斑块组织,以及对照组中7例术中所切除的相对正常的锁骨下动脉及无名动脉组织,采用Western印迹方法,检测并比较其中的20S蛋白酶体及蛋白酶体α亚单位的蛋白质水平.结果 ①病例组和对照组各7例,病例组的高脂血症、糖尿病及吸烟比率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;②蛋白酶体所有α亚基（1-7）在正常动脉内膜、动脉粥样斑块组织中的表达差异无统计学意义（P均＞0.05）;③20S蛋白酶体在动脉粥样斑块组织中的表达水平明显低于对照组（P＜0.05）.结论 20S蛋白酶体可能在动脉粥样硬化斑块的病理变化过程中起着重要的作用,而蛋白酶体α亚单位在其中的作用有待进一步探讨.

脑胶质瘤PSMA5的表达、功能及临床意义

目的 研究蛋白酶体Alpha-5亚单位(PSMA5)在脑胶质瘤中的表达情况、功能及临床意义。方法 利用获取自癌症基因组图谱(TCGA)和中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)的胶质瘤样本信息,通过生物信息学方法分析PSMA5的表达情况。利用DESeq2 R程序包筛选出差异表达基因(DEGs),并通过基因本体论(GO)和基因集富集分析(GSEA)进行功能富集分析。利用单因素和多因素Cox回归分析和Kaplan-Meier法评估PSMA5对患者预后的影响。利用SiRNA敲低PSMA5的表达以探究其对胶质瘤细胞生长的影响。结果 PSMA5在胶质瘤患者中呈高表达(P<0.05),且在高级别胶质瘤及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)野生型胶质瘤患者中有更高的表达水平(P<0.05)。GO和GSEA分析结果显示,PSMA5与免疫反应、有丝分裂等密切相关。Cox分析的结果表明,PSMA5的高表达是胶质瘤的一个显著独立预后因素(CGGA:P<0.01,TCGA:P=0.032);Kaplan-Meier法结果表明,PSMA5高表达组的患者生存期明显少于低表达组(P<0.001)。敲低PSMA5后,胶质瘤细胞增殖受抑制,诱发细胞周期停滞。结论 PSMA5的高表达水平会导致患者的不良预后,PSMA5可以作为胶质瘤患者预后的预测因素。此外,PSMA5还有作为治疗胶质瘤的生物靶点的潜在作用。

PSMB5基因沉默对运动促进小鼠海马神经发生的影响

目的:观察20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)基因沉默在小鼠自主跑轮运动促进海马神经发生中的作用。方法:BABL/c小鼠随机分为慢病毒对照组(Lenti-ctrl-shRNA)和靶向PSMB5的shRNA重组慢病毒感染组(Lenti-PSMB5-shRNA)。小鼠海马通过立体定位注射感染慢病毒,2周后应用Western Blot检测PSMB5基因沉默效率,随后小鼠自主跑轮运动4周。应用荧光酶标仪检测蛋白酶体活性,Ki67、DCX免疫荧光染色观察海马齿状回神经干细胞(NSCs)的增殖分化潜能,Y迷宫自发交替和新物体识别实验观察小鼠学习记忆能力。结果:Lenti-PSMB5-shRNA组小鼠海马PSMB5蛋白表达水平较Lenti-ctrl-shRNA组下降44.59%(P <0.01),海马蛋白酶体活性较Lenti-ctrl-shRNA组下降37.66%(P <0.01)。Lenti-PSMB5-shRNA组小鼠SGZ区Ki67阳性细胞数较Lenti-ctrl-shRNA组显著降低(P <0.05),DCX阳性细胞数较Lenti-ctrl-shRNA组显著降低(P <0.05)。Lenti-PSMB5-shRNA组小鼠Y迷宫自发交替率较Lenti-ctrl-shRNA组明显下降(P <0.05)。Lenti-PSMB5-shRNA组小鼠新物体识别正确率与Lenti-ctrl-shRNA组相比明显下降(P <0.05)。结论:PSMB5基因沉默导致小鼠海马蛋白酶体活性下降,进而抑制了运动对海马神经发生的促进作用,提示蛋白酶体活性在自主跑轮运动促进海马神经发生的过程中起重要作用。

靶向PSMB5基因的shRNA慢病毒载体对神经干细胞增殖和分化潜能的影响

目的:优化20S蛋白酶体β5亚单位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制。方法:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0)NSCs。倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性。比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响。Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响。结果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达。其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49%±4.81%(P<0.001)和33.1%±2.54%(P<0.001)。PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4%±1.48%(P<0.01)。shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5±9.5(P<0.01),神经球的平均直径为29.9μm±2.6μm显著低于对照组42.9μm±2.3μm(P<0.01)。CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03(P<0.001),PSMB5-shRNA组Tuj1+阳性率为39.13%±8.14%,较对照组显著降低(P<0.01)。结论:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。

miR-26、TGF-β1、REGγ在子宫内膜癌组织中的表达及相关性研究

目的 探讨微小RNA-26(miR-26)、转化生长因子β1(TGF-β1)、蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物γ亚单位(REGγ)在子宫内膜癌组织中的表达及相关性。方法 收集60例子宫内膜癌组织(内膜癌组)、20例子宫内膜增生组织(内膜增生组)、20例正常增殖期子宫内膜组织(正常组),实时荧光定量PCR(qPCR)法检测子宫内膜组织中miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平。比较三组子宫内膜组织中miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平差异;收集子宫内膜癌患者临床病理特征,分析其临床病理参数与miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平关系;Pearson法分析子宫内膜癌组织miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平之间及其与临床分期、分化程度的相关性;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平对子宫内膜癌的诊断价值。结果 正常组、内膜增生组、内膜癌组,miR-26表达水平依次降低,TGF-β1、REGγ表达水平依次升高,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。子宫内膜癌组织中的miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平与其临床分期、组织分化和淋巴结转移有关(P<0.05),与肌层浸润程度无关(P>0.05)。子宫内膜癌组织miR-26表达水平与TGF-β1、REGγ表达水平均呈负相关关系(P<0.001),而TGF-β1、REGγ表达水平之间呈正相关关系(P<0.001);miR-26表达水平与临床分期呈负相关关系,与分化程度呈正相关关系(P<0.001);TGF-β1、REGγ表达水平与临床分期呈正相关关系,与分化程度呈负相关关系(P<0.001)。子宫内膜癌患者miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平诊断子宫内膜癌的AUC分别是0.705/0.745/0.760,低于联合诊断方法的0.861。结论 miR-26、TGF-β1、REGγ在子宫内膜癌组织中表达异常,与临床分期、组织分化程度相关,且三者之间互相相关,联合用于诊断子宫内膜癌的临床价值显著。

PSMB5对多发性骨髓瘤细胞增殖和硼替佐米耐药的影响及其机制研究

目的探讨蛋白酶体D5亚单位（PSMB5）基因对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖和硼替佐米（BTZ）耐药的影响及其机制。方法以MM细胞株RPMI8226细胞和BTZ耐药细胞株RPMI8226／BTZ100（简称BTZ100）细胞为研究对象，采用慢病毒转染的方法建立过表达和下调PSMB5表达的MM稳转细胞系；CCK8法检测PSMB5对MM细胞增殖和BTZ耐药性的影响；流式细胞术检测PSMB5对细胞凋亡的影响；Westernblot法检测PSMB5对凋亡相关基因Bax、Bcl-2、P—Akt和Cleavedcaspase．3表达的影响。结果①成功构建稳定过表达和下调PSMB5表达的RPMI8226和BTZ100细胞系。②PSMB5表达与RPMI8226和BTZ100细胞增殖呈正相关（P值均〈0．05）。③下调PSMB5表达后，在相同浓度的BTZ作用下RPMI8226细胞活力较对照组降低[作用24h时IC50分别为（7．01±0．47）、（9．64±0．55）nmol／L，t=6．289，P=0．003]，过表达后的细胞活力较对照组升高[IC50分别为（10．99±0．58）、（9．51±0．37）nmol／L，t=3．724，P=0．020]。④PSMB5表达可促进BTZ诱导的RPMI8226、BTZ100细胞凋亡，与对照组比较，差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。⑤下调PSMB5表达可上调Bax和Cleavedcaspase-3表达，降低Bcl-2和p-Akt表达，而过表达则相反。结论下调PSMB5表达可通过激活凋亡信号通路促进MM细胞凋亡，增强MM细胞对BTZ的敏感性。提示PSMB5可能是治疗MM的潜在靶点。

氧化环境下PSMB5基因对人晶状体上皮细胞的保护作用

目的:研究氧化环境下高表达蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对人晶状体上皮细胞的保护作用。方法:实验研究。建立稳定过表达PSMB5的人晶状体上皮细胞株(实验组),以空白载体转染细胞株为对照组。通过Western blot法分别检测2组细胞内PSMB5、蛋白酶体β2亚单位(PSMB7)和蛋白酶体β1亚单位(PSMB6)蛋白表达情况;人工合成的多肽Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(LLVY)、Boc-Bal-Gly-Arg-AMC(VGR)及Z-Leu-Leu-Glu-βNA(LLE)分别检测2组细胞内PSMB5、PSMB7和PSMB6蛋白活性的变化;并将2组细胞置于40μmol/L H2O2环境下,观察细胞增殖能力的变化及细胞内羰基化蛋白含量改变的情况。数据采用独立样本t检验进行比较。结果:转染PSMB5的实验组人晶状体上皮细胞株内PSMB5蛋白的表达量较对照组高,同时PSMB6和PSMB7蛋白的表达量也相对高;而相应蛋白酶体亚单位的蛋白酶活性也显著增加。在40μmol/L H2O2环境下处理4 h后,对照组和实验组细胞的增殖能力均受到抑制,2组细胞的增殖率分别为(6.99±3.43)%和(72.47±5.56)%,但对照组细胞的增殖能力受到抑制的程度明显高于实验组,2组之间的差异有统计学意义(t=22.41,P<0.001)。经过相同处理后,对照组和实验组细胞内羟基化蛋白含量分别为(2.65±0.44)nmol/mg和(1.63±0.36)nmol/mg,均高于处理前[分别为(0.41±0.10)nmol/mg和(0.45±0.12)nmol/mg],但是实验组细胞内氧化蛋白含量明显低于对照组细胞内氧化蛋白的含量,差异具有统计学意义(t=4.01,P=0.008)。结论:氧化环境下,高表达PSMB5基因提高了人晶状体上皮细胞内蛋白酶体的活性及抗氧化能力,具有保护作用。