苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4 0 718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 2 0kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,高效表达了 14 1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的 5 0 %以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30 4构建表达质粒pHTX4 2 ,电转化Bt无晶体突变株XBU0 0 1,获得重组菌株HTX4 2 ,经SDS PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的 79 2 8% ,且其在细胞中累积达细胞干重的 6 4 13% ,比文献报道的 2 5 %左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌 (E .coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小 ,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体 ,大小约为 1 2 μm× 2 0 μm。生测结果显示 ,包涵体与晶体对小菜蛾 (Plutellaxylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中 2 0kbDNA分?