散寒化湿颗粒对人冠状病毒229E和OC43感染致小鼠肺炎的作用机制研究

目的考察散寒化湿颗粒对人冠状病毒229E毒株和OC43毒株感染小鼠致肺炎模型的作用机制。方法根据不同毒株将实验分批进行,每批实验动物按体重随机分成7组:正常组、病毒感染组、磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、散寒化湿颗粒(给药组)3个剂量组,高剂量为11 g·kg^(-1)·d^(-1)(相当于生药52.8 g·kg^(-1)·d^(-1))、中剂量为5.5 g·kg^(-1)·d^(-1)(相当于生药26.4 g·kg^(-1)·d^(-1))、低剂量为2.75 g·kg^(-1)·d^(-1)(相当于生药13.2 g·kg^(-1)·d^(-1))。使用人冠状病毒229E和OC43感染小鼠,建立肺炎模型。通过检测肺指数和肺部病理变化等指标评价散寒化湿颗粒对冠状病毒肺炎小鼠的药理作用。结果散寒化湿颗粒在高、中、低3个剂量组均能有效降低小鼠的肺指数,并减轻肺组织的病理损伤。结论散寒化湿颗粒对人冠状病毒229E毒株和OC43感染致小鼠肺炎均具有治疗作用。

利用邻位标记-质谱联用技术发掘冠状病毒HCoV-229E互作宿主因子

目的通过邻位标记-质谱联用与生物信息学分析结合筛选与人冠状病毒229E(HCoV-229E)核衣壳蛋白(NP)相互作用的潜在宿主因子,并利用免疫共沉淀等技术验证,寻找HCoV-229E NP的相互作用蛋白,为揭示病毒复制增殖的分子机制,及不同人冠状病毒致病力差异奠定基础。方法首先构建了表达HCoV-229E NP与生物素连接酶标签融合蛋白(NP-TurboID)的重组腺病毒Ad-V5-NP^(HCoV-229E)-TurboID(Ad-N),感染人非小细胞肺癌细胞A549,48 h后添加外源生物素,通过生物素连接酶标记NP相互作用蛋白,利用链霉亲和素交联的磁珠纯化生物素标记蛋白,而后进行无标记(label-free)蛋白质组学质谱分析,筛选出潜在的与NP互作的蛋白质,并通过免疫沉淀和免疫荧光等实验进行验证。结果无标记蛋白质组学质谱筛选出584个潜在互作蛋白,从中选取糖原合成酶激酶3(GSK3)A和GSK3B进行免疫共沉淀和免疫荧光验证,实验结果表明,二者与NP^(HCoV-229E)存在相互作用。结论邻位标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用因子的挖掘,为进一步研究冠状病毒复制、增殖及致病机制奠定了基础。

清热化湿抗毒方对229E型人冠状病毒的体外抑制作用研究

目的 研究清热化湿抗毒方对229E型人冠状病毒(HCoV-229E)的体外抑制作用。方法 采用体外MRC-5及HuH-7细胞模型分析清热化湿抗毒方的药物毒性及抗HCoV-229E的体外药效,通过空斑实验验证其对HCoV-229E的抑制作用。设置预防给药组、感染期给药组和清热化湿抗毒方高、中、低剂量组,采用实时荧光定量PCR法检测清热化湿抗毒方对病毒RNA表达的抑制作用;免疫荧光法检测病毒结构蛋白的表达;并对各组病毒上清液的半数组织感染量(TCID50)、核酸拷贝数、炎症因子水平进行检测。结果 清热化湿抗毒方对MRC-5和HuH7细胞的半数毒性浓度(TC50)分别为8.481、 7.793 mg/mL,对HCoV-229E的半数抑制浓度(IC50)分别为0.798、 1.101 mg/mL,治疗指数分为10.628、 7.078;且对MRC-5感染HCoV-229E后病毒空斑的形成具有抑制作用。在RNA和蛋白表达方面,清热化湿抗毒方各剂量组可不同程度地抑制细胞内HCoV-229E的复制。而在病毒上清液中,清热化湿抗毒方可降低活病毒载量、核酸拷贝数及炎症因子IL-6水平。结论 清热化湿抗毒方具有较好的体外抗HCoV-229E药物活性,其抗病毒机制可能与差异调控miRNA直接靶向病毒RNA或宿主炎症应答基因发挥抑制作用有关。

杜229块超稠油油藏二次开发潜力研究及认识

针对杜229块蒸汽吞吐开发后期暴露出的采油速度低、吞吐效果差、北部低效区储量有效动用难、产量递减快、采收率低等一系列开发矛盾,运用精细油藏管理理念,进行了精细油藏地质研究、区块剩余油分布规律研究和二次开发部署研究;并利用井间加密水平井、SAGD、蒸汽驱等二次开发技术进行了二次开发先导试验井组的试采,达到提高最终采收率、增加可采储量、延缓递减、实现区块稳产的目的。对区块下步转换开发方式及稳产起到了保障作用,对同类型油藏的二次开发具有重要的指导意义。

氮肥运筹对面条小麦品种陕农229淀粉品质的影响

以适宜做面条的优质中筋小麦陕农 2 2 9为试验材料 ,研究了不同氮肥施用量和基施追施之比对面条小麦籽粒淀粉性状和面粉糊化特性的影响。结果表明 ,适当增加施氮量和拔节期追施氮比例可降低籽粒淀粉含量、直链淀粉含量、淀粉直 支值 ,提高面粉的峰值粘度、低谷粘度、最终粘度和稀懈值。淀粉含量、直链淀粉含量和淀粉直 支值与主要粘度参数间均存在负相关 ,淀粉直 支值与主要粘度参数间负相关性较高。本试验中 ,陕农 2 2 9以施氮量为 2 6 2 .5kg hm2 、基追比 6∶4～ 5∶5处理的直链淀粉含量及直 支值较低而峰值粘度和稀懈值较高 ,且产量较高 ,是面条小麦较理想的氮肥运筹方式。

优质强筋小麦济麦229选育实践与思考

济麦229是山东省农业科学院作物研究所继济南17、济麦20之后新近育成的优质强筋小麦品种,同时达到国家一等强筋小麦标准(GB/T17892—1999)和郑州商品交易所期货用的一等强筋小麦标准,是订单生产非常理想的品种。本文对济麦229的选育实践如育种目标确立、亲本选配、选育技术和方法、特征特性、产量表现、品质性状、特别是选育体会进行总结分析,期望对优质强筋小麦品种选育提供借鉴。

人参皂苷Rd高产突变株Paecilomyces bainier sp229-7的生长特性和生物转化

目的通过研究突变株拟青霉菌sp229-7(Paecilomyces bainiersp229-7)的生长及转化底物情况,探讨突变株转化三七茎叶总皂苷的高效性。方法在不同条件下,运用摇瓶转化法考查菌株生长和转化底物特性;分别采用静息态细胞、胞外酶以及粗酶液,测定其对底物转化情况。结果菌体12～48 h之间生长最旺盛,36 h加入底物转化率最高,加入底物后72 h转化基本结束,转化产物只有人参皂苷Rd,底物投料量至少可以达到20 mg/mL,克分子转化率达80%以上,转化温度27℃～32℃之间最佳。静息态细胞、胞外酶以及粗酶液都可以将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd。结论与文献报道相比,Paecilomyces bainiersp229-7突变株具有良好的底物耐受性和专一性,快速生长的后期是底物投料的最佳时机,Rb1转化为Rd的时间缩短为3 d,投料量至少增加20倍,显著提高了转化效率,可望应用于工业生产。突变株的高转化效率可能与转化酶由细胞内产生并部分分泌到胞外有关,增加了酶与底物接触机会,避免了产物在胞内过量积累。

RUNX2在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA对Hela229细胞RUNX2表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RUNX2蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及RUNX2 siRNA对宫颈鳞癌Hela229细胞RUNX2基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测50例宫颈鳞癌、30例宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及30例正常宫颈黏膜组织中RUNX2蛋白的表达情况,并分析宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白表达与临床病理特征的关系。设计合成RUNX2 siRNA,通过脂质体将其转染至Hela229细胞,同时设立空白对照(不转染)和阴性对照(转染非特异性siRNA)细胞组。转染24、48、72 h后,采用MTT法检测各组细胞增殖,计算增殖抑制率;转染72 h后,采用RT-PCR及Western blot技术检测细胞中RUNX2 mRNA及蛋白的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:宫颈鳞癌组织中RUNX2阳性表达率高于HSIL及正常宫颈组织(P<0.001);宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白的表达与肿瘤的临床分期有关(P=0.004)。与空白对照组和阴性对照组比较,RUNX2 siRNA组Hela229细胞增殖抑制率、RUNX2 mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论:RUNX2基因的高表达与宫颈鳞癌细胞的增殖关系密切。

沈229元古界潜山储层特征及物性参数解释

沈229潜山主要储集岩为石英砂岩和白云岩,储集空间以构造裂缝为主,构造裂缝不仅可以作为部分储集空间,同时也可作为主要的渗流通道。岩性是构造裂缝发育的内因,构造应力是形成构造裂缝的外因,风化雨淋作用影响着构造裂缝的空间分布状况。储集岩石类型的多样性、储集空间的复杂性使得储层具有严重的非均质性,这给测井解释和评价带来了一定的难度。从岩石成份入手分析储层特征,并应用岩心分析技术、交会图技术、经验公式等建立了储层孔隙度、渗透率、饱和度参数的解释模型,实现了裂缝型潜山油藏储层参数的测井定量解释,初步形成了该类储集层的测井评价方法,实际应用效果比较显著。

229Th的分离和测量方法

229 Th是一个适合于同位素稀释质谱法(IDMS)分析环境样品中钍同位素浓度的同位素稀释剂。建立了一种稳定可靠的从233 U溶液中提取高纯229 Th同位素稀释剂的方法,该方法采用串联阴离子交换柱分离U和Th同位素,全流程238 U和232 Th的回收率接近100%。采用多接收电感耦合等离子体质谱(MC-ICP-MS)反同位素稀释法准确标定了制备的229 Th同位素稀释剂的浓度,为1.959×10^-9(1±0.5%)g/g,230 Th与229 Th的同位素比值为3.322×10^-3,并根据测量过程评定了稀释剂浓度的不确定度。

黄芪成分F3新制剂对人CCL-229、K562癌细胞的抑制作用

目的 研究黄芪成分F3新制剂对人大肠癌CCL -2 2 9,人红白血病K5 62细胞株的抑制作用。方法 实验分为F3单药组、联合用药组、顺铂组 ,另设空白对照组。应用四氮甲唑蓝 (MTT )实验观察细胞的生存、增殖状态 ;应用细胞形态学、基因组DNA电泳、流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 一定浓度范围内的黄芪成分F3新制剂直接用药和联合用药均具有明显的生长抑制作用 ,透射电镜下可见凋亡细胞 ;基因组DNA电泳出现“阶梯状”条带 ;流式细胞仪分析出现低于G1期DNA含量的亚二倍体Apoptosis凋亡峰。 结论 黄芪成分F3新制剂对大肠癌CCL -2 2 9及人红白血病K 5

多柔比星叶酸隐形脂质体对HeLa229荷瘤裸鼠的抑瘤作用

考察多柔比星(1)叶酸隐形脂质体对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用。以pH梯度法分别制备了多柔比星叶酸隐形脂质体(1-FSL)和普通脂质体。比较两者在荷瘤裸鼠瘤旁给药后对瘤体动态变化趋势、瘤体组织病理学差异和瘤体中肿瘤细胞内DNA质量的影响等。结果表明,1-FSL对荷瘤裸鼠具有显著的抑瘤效果,1-FSL抑瘤率略高于普通脂质体,但两者抑瘤特性明显有别。

Hedgehog通路相关分子SMO、Gli-1在放疗诱导HeLa-229细胞株的激活研究

目的:研究Hedgehog(Hh)通路相关分子SMO、Gli-1在放疗诱导宫颈癌HeLa-229细胞株中的变化。方法:采用多次不同分割剂量照射技术方法对HeLa-229细胞株进行放疗处理,照射剂量及次数分别为0Gy(T-1组)、2Gy×12次(T-2组)、4Gy×6次(T-3组)和6Gy×4次(T-4组)。采用克隆形成实验测定细胞克隆能力,流式细胞学检测细胞周期分布情况,实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中SMO、Gli-1在Hh通路中的表达情况。结果:T-1、T-2、T-3和T-4组中HeLa-229细胞的克隆形成率分别为(15.3±3.5)%、(89.3±5.1)%、(52.0±4.4)%和(55.0±15.0)%,S期细胞比例分别为(23.7±5.5)%、(23.6±2.7)%、(20.2±2.1)%和(20.0±2.5)%,增殖指数分别为(36.9±5.0)%、(34.1±3.5)%、(30.0±2.3)%和(30.1±4.1)%。RT-PCR检测结果显示,与T-1比较,T-2组中SMO表达上调(P<0.05);T-2及T-4组中Gli-1表达均显著上调(P均<0.05)。Western blot检测结果显示,与T-1比较,T-2组中SMO表达显著上调(P<0.05);T-2组中Gli-1表达上调(P<0.05)。结论:小剂量诱导照射对HeLa-229细胞株的Hh通路中SMO与Gli-1表达影响最显著。

^(229)Ra的衰变

用１４ＭｅＶ中子轰击钍靶，通过２３２Ｔｈ（ｎ，α）２２９Ｒａ反应产生２２９Ｒａ，用放射化学方法从被照靶物质中分离出２２９Ｒａ。利用γ（Ｘ）谱学方法，首次观测到了能量分别为１４．５，１５．６，１８．８，２１．８，２２．５，４４．０，４７．５，５５．０，６３．０，６９．６，９３．６，９４．１，９８．５，１０２．２，１０４．５，１０６．１，１６１．１，１７１．５ｋｅＶ的２２９Ｒａ衰变的１８条新γ射线，建立了２２９Ｒａ的部分衰变纲图。

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位，对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229EN蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV—OC43和HCoV-229EN蛋白的重组痘苗病毒，并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法，检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时，用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoVN蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明，SARS-CoV、HCov-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达；3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示，SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30～60aa、170～184aa、301～320aa和360～422aa；与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30～60aa、90～120aa、204～214aa和320～360aa；与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30～60aa、150～160aa和301～360aa。含SARS-CoVN蛋白特异表位的重组肽N155b（60～214aa）和N185（30～214aa）只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应，而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoVN蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究，提供了重要的实验依据。

aFGF和genistein对大肠癌细胞株CCL229 PKC及ERK活性的影响

目的:观察aFGF及TPK抑制剂genistein对大肠癌细胞株CCL229细胞内PKC及ERK活性的影响,探讨其信号传导途径.方法:以不同浓度的aFGF(0.15 mg/L,0.30 mg/L,0.60mg/L,1.20 mg/L)和genistein(6.00mg/L,12.00mg/L,24.00mg/L,48.00mg/L)诱导CCL229细胞,利用[γ-^(32)P]ATP掺入外源性底物的方法,液体闪烁测定PKC及ERK活性.结果:随着aFGF浓度的增加,PKC及ERK活性随之升高,与aFGF浓度呈显著正相关(P<0.05).当aFGF浓度为1.20mg/L时,PKC(胞质),PKC(胞膜)和ERK活性分别为对照组的2.60,2.79,1.77倍.genistein抑制细胞内PKC及ERK活性,且与 genistein 浓度呈剂量依赖效应(P<0.05).当genistein浓度为48.00mg/L时,PKC(胞质),PKC(胞膜)和ERK活性分别为对照组的0.41,0.36,0.50倍.genistein对aFGF诱导的PKC及ERK活性抑制更显著.结论:大肠癌细胞株CCL229中aFGF受体具有TPK活性,TPK激活后促进蛋白质和酶磷酸化,导致PKC和ERK活性升高,进一步证明PKC及ERK确是TPK的下游信号分子.

p65 siRNA联合顺铂对宫颈癌HeLa229细胞增殖及侵袭力的影响

目的通过RNA干扰(RNAi)阻断宫颈癌细胞HeLa229中核因子(NF)-κB信号通路,观察其单独或与顺铂(DDP)联合对HeLa229增殖、耐药性和侵袭力的影响。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为未转染组(A组)和转染p65小干扰RNA(siRNA)组(B组),用MTT法检测转染p65 siRNA 24、48、72 h时HeLa229的增殖情况;加入不同浓度DDP,观察其对HeLa229细胞增殖的影响。用Boyden chamber体外侵袭实验检测A、B组及p65siRNA与DDP(8.6 mg/L)联合组(C组)细胞侵袭力的变化。结果B组细胞存活率较A组明显下降;加入DDP后,A、B组细胞的存活率均随DDP浓度的增加而下降。siRNA与DDP联合应用可明显提高HeLa229对DDP的敏感性。与A组相比,B、C组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P<0.05)。结论应用RNAi技术可有效阻断HeLa229内NF-κB信号通路,抑制其增殖和体外侵袭力,增强其对DDP的敏感性。

人冠状病毒229E湿热疫毒袭肺病证结合小鼠模型的建立及评价

目的在采用外部湿热因素造成中医湿毒袭肺小鼠模型的基础上,同时采用人冠状病毒229E(HCoV-229E)感染小鼠造成肺炎模型,建立湿热疫毒袭肺病症结合小鼠模型。方法对湿热感染不同天数的小鼠中医证候表征、肺指数和肺部病毒载量、肺部病理结构与影像学、小鼠血清胃泌素(Gas)、下丘脑前列腺素E2(PGE2)、环磷酸腺苷(c AMP)及肌糖原评价湿毒疫动物模型。结果人冠状病毒肺炎湿热疫毒袭肺证小鼠病证结合模型小鼠饮食量下降和饮水量增加,毛发枯燥发黄,行动迟缓爱扎堆,大便便溏。肺指数增加(P<0.01),肺部病毒核酸呈阳性表达,肺组织可见病理结构变化及斑点状阴影。小鼠体内肌糖原含量、血清胃泌素含量、下丘脑c AMP、PGE2的含量在感染后均有显著升高(P<0.05)。结论本研究建立的HCoV-229E湿热疫毒袭肺证病证结合小鼠模型与临床疾病表征具有一致性,可为诊断及治疗具有该证候的病毒性肺炎与开发相关药物研究提供一种可靠的评价动物模型。

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21(DE3)中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。

曙光油田杜229块蒸汽吞吐后期转蒸汽驱试验技术

杜229块超稠油油藏蒸汽吞吐开发采出程度达到22.5%,可采储量采出程度高达96.3%,转换开发方式势在必行。针对该油藏地质特点及开发现状,开展转蒸汽驱方式可行性研究。结果表明,该油藏适合蒸汽驱开发,可提高采收率25%。综合研究后确定,在该块中部选取4个井组开展蒸汽驱先导试验,并对井组注采参数进行优选。经过一段时间的试验,先导试验井组已进入蒸汽驱驱替阶段,瞬时油汽比达到0.16,井组年综合递减率下降10%,蒸汽驱见到初步效果。该研究对于区块下步转换开发方式及稳产起到了保障作用,对同类型油藏转蒸汽驱开发具有重要的指导意义。