利用SPR检测26肽与β_1-肾上腺素受体自身抗体的相互作用

目的探讨根据β_1肾上腺素受体细胞外第二环(β_1-adrenergic receptor,β_1-AR-EC_Ⅱ)的氨基酸序列合成的26肽与β_1-肾上腺素受体β_1-AR-EC_Ⅱ的单克隆抗体(β_1-adrenergic receptor autoantibodies,β_1-AA)的相互作用。方法根据人β_1-肾上腺素受体细胞外第二环(β_1-AR-EC_Ⅱ)的氨基酸序列合成26肽;采用杂交瘤细胞融合的方法获得针对β_1-AR-EC_Ⅱ的单克隆抗体(β_1-AA);利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)检测该合成的26肽与β_1-AA的亲和力;利用乳鼠心肌细胞跳动频率实验验证该合成26肽对β_1-AA的中和作用。结果提取的β_1-AA可以使乳鼠心肌细胞跳动频率增加(P<0.05),提示该β_1-AA具有生物学活性;合成26肽与β_1-AA结合的亲和力(K_D)为4.44μmol/L,属于中等强度结合;较β_1-AA组相比,26肽处理后可明显降低心肌细胞跳动频率(P<0.05)。结论该合成26肽与β_1-肾上腺素受体自身抗体之间存在相互作用,并且可以拮抗β_1-AA引起的乳鼠心肌细胞跳动频率的增加。

寡聚苯乙炔修饰RM26的177Lu标记和细胞内化研究

促胃泌素多肽受体(gastrin-releasing peptide receptor,GRPR)在多种肿瘤细胞中过度表达,可以被GRPR拮抗剂靶向。高的细胞内化率有助于提高放射性治疗药物的治疗效果,减少给药剂量。激动剂的内化率优于拮抗剂,但是严重的副作用限制了激动剂的应用。将具有跨膜能力的寡聚苯乙炔(OPE)和GRPR拮抗剂RM26偶联,可以提高拮抗剂的内化能力。本研究合成了两种多功能化合物NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26,分别进行^(177)Lu标记,得到了高放化纯度的标记物。标记化合物^(177)Lu-NOTA-OPEs-RM26在生理盐水、高糖培养液、新生牛血清中稳定存在。体外稳定性实验表明,引入OPE-1少量增加了化合物的内化率,而引入OPE-2显著增加了化合物的内化率。此外,引入OPE并没有改变RM26的特异性结合能力。实验结果表明,引入跨膜基团提高拮抗剂药物细胞内化率可行。

衍生自人ⅡA型磷脂酶A_2碳末端的多肽C-26杀菌作用研究

目的:考察衍生自人ⅡA型磷脂酶A(2ⅡA型PLA2)碳(C)末端的多肽C-26对不同细菌的体外杀菌作用。方法:根据人ⅡA型PLA2C末端26个氨基酸残基的顺序,合成多肽C-26。采用琼脂铺板计数法,将不同浓度的多肽C-26分别与6种细菌(金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌)在37℃孵育2h,然后铺板并置于37℃恒温箱培养18～24h,记录每一琼脂板上的菌落形成单位(cfu),计算出多肽C-26作用后对细菌的杀菌率。结果:多肽C-26对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌等革兰阳性(G+)细菌的杀菌作用较强,其杀灭99%细菌的浓度在250～1000mg·L-1之间;对大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌等革兰阴性(G-)细菌的杀菌作用较弱,其浓度在500mg·L-1时对三者的杀菌率为41%～52%。结论:多肽C-26有杀菌作用,推测其具有与ⅡA型PLA2及其他抗菌多肽相似的杀菌机制。

膜联蛋白A1拟肽Ac2-26减轻大鼠体外循环肺损伤的抗炎机制

目的探讨膜联蛋白A1(AnxAl)拟肽Ac2-26对体外循环(CPB)大鼠肺损伤的影响,分析其抗炎机制。方法18只雄性SD大鼠,体质量350~450 g。随机数字表法分为3组(各6例):假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、Ac2-26组(A组)。假手术组行股动静脉穿刺置管,仅开胸暴露左肺,不连接CPB管道;其余2组均建立CPB左肺缺血再灌注损伤模型,IR组在CPB前10 min给予同等容量的生理盐水;A组在CPB前10 min尾静脉注射Ac2-26(1 mg/kg)。3组大鼠于CPB前(T1)、开放左肺门即刻(T2)、实验结束时(T3)分别取动脉血,行血气分析,计算氧合指数(OI)和呼吸指数(RI)。于T1、T3分别取股静脉血测中性粒细胞(PMN)的数量。T3时取肺动脉血测PMN的数量、大鼠血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量;取左肺组织,ELISA法测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)和PMN弹性蛋白酶(NE)含量,Tunel法测肺组织中性粒细胞凋亡;Western-Blot测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和AnxAl蛋白表达情况。结果与S组比较,IR组T3时点的股静脉血、肺动脉血PMN数量及肺动脉VCAM-1含量高,肺组织MPO、NE含量增加,肺组织病理损伤评分升高、OI降低、RI升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较,A组大鼠肺组织病理损伤评分明显降低,股静脉血、肺动脉血PMN数量及肺动脉血VCAM-1含量明显减少,肺组织AnxA1、ICAM-1表达降低,肺组织MPO、NE含量降低,PMN凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论膜联蛋白A1拟肽Ac2-26可抑制肺内中性粒细胞聚集,减弱中性粒细胞与肺血管内皮的黏附能力,促进肺内中性粒细胞凋亡,降低NE、MPO含量,对大鼠CPB后肺损伤有保护作用。

日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及其免疫保护作用评价

目的:构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP),3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH),26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗,并通过药理实验评价其抗血吸虫感染的免疫保护作用。方法:以血吸虫成虫RNA为模板制备cDNA第一链,RT-PCR扩增得到抗原基因片段,再通过重组PCR技术,将Sj26和SjGAPDH融合为Sj26.SjGAPDH基因。将SjFABP和Sj26.SjGAPDH分别克隆入pVIVO2的mcs1和mcs2,获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH。瞬时转染MCF-7细胞,通过逆转录PCR(RT-PCR)检测抗原基因在mRNA水平的表达,通过间接荧光免疫(IIF)检测抗原基因在小鼠体内抗原水平表达,验证了DNA疫苗的有效性;并免疫小鼠后进行免疫保护性初步试验。结果:经过酶切、测序及体内外表达验证,该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH构建成功;该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.8%。结论:该三价DNA疫苗组具有比单价和双价DNA疫苗组更加良好的免疫保护作用,为日本血吸虫DNA疫苗的研制奠定了基础。