PCR技术检测棘阿米巴26S核糖体DNA

目的:用聚合酶链反应(PCR)方法检测棘阿米巴的26S核糖体DNA(26S rDNA,Rns),为早期诊断棘阿米巴角膜炎提供方法。方法:分离培养三株不同基因型棘阿米巴虫株,提取虫株基因组DNA,合成棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a),通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分26SrDNA序列。结果:三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp.CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型。PCR扩增后,Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126 bp的特定扩增带,而Acanthamoeba sp.CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段则未得到预期的扩增带。结论:用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供新的检测手段。

改良RACE技术克隆板栗短雄花序26S核糖体基因片段

RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术是以RT-PCR为基础,根据部分已知基因序列(如EST),通过cDNA的3′端和5′端快速扩增获取全长cDNA的一种有效方法。本文作者以板栗芽变品种短雄花序为材料,利用改良SMART RACE的技术克隆了板栗(Castanea mollissimaBlume)26S基因5′端未知序列,所得到的cDNA的5′末端共有1 204 bp。序列比对分析显示,该检测的核糖体基因与已知其他物种中的核糖体基因高度同源,它与已克隆到的同源基因橡树和八角枫之间的同源性分别为98%和97%。

核糖体蛋白S26的研究进展

核糖体蛋白(ribosomal proteins,RPs)不仅在细胞内参与合成蛋白质,还具有多种核糖体外功能。核糖体蛋白S26(RPS26)位于核糖体小亚基,其功能障碍与多种疾病密切相关。近年来,有关RPS26的研究主要在参与核糖体装配等核糖体功能方面,以及参与无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)、直接或间接调控重要的抑癌基因p53表达等核糖体外功能方面。多篇报道证实RPS26基因突变可引起戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia,DBA),而RPS26基因与Ⅰ型糖尿病的关系仍有争议。探索RPS26参与NMD机制在DBA发生中的作用有助于深入认识DBA发病机理,同时也可为完善SMaRT(spliceosome-mediated mRNA trans-splicing)技术等基因疗法提供帮助。此外,RPS26在癌症中的作用也值得进一步探索。

多囊卵巢综合征患者核糖体蛋白基因S26与内分泌激素水平相关性研究

目的探讨多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者核糖体蛋白基因S 26(ribosomal protein gene S 26,RPS 26)不同基因型的内分泌激素指标之间是否存在相关性。方法选取2015年7月至2016年3月在深圳市龙华区人民医院就诊的PCOS患者100例,进行基因测序RPS 26的rs56696262基因型,对比不同基因型的年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、抗苗勒氏管激素(antiMüllerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、催乳素(prolactin,PRL)、雌二醇(estradiol,E_2)、睾酮(testosterone,T)、性激素结合球蛋白(sex hormonebinding globulin,SHBG)、游离雄激素指标(free androgen index,FAI),再将rs 56696262位点的3种基因型与以上指标进行相关性分析。结果rs 56696262位点共有3种基因型,A/A(4/100),A/T(31/100),T/T(65/100),因为A/A的病例数太少,无法进行数据分析。对A/T和T/T两组病例的研究中得出BMI、T和FAI差异有统计学意义(P<0.05),存在相关性;但年龄、AMH、FSH、LH、PRL、E_2、SHBG比较差异无统计学意义(P>0.05),不存在相关性。结论本研究未发现rs 56696262位点的A/T和T/T基因型与年龄、AMH、FSH、LH、PRL、E_2、SHBG存在明显相关性,而A/T组和T/T组的BMI、T、FAI与rs 56696262位点存在相关性。

白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测及抗真菌药物敏感性分析

目的:建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应方法,快速定量检定临床标本中的白色念珠菌并进行抗真菌药物敏感性分析。方法:针对白色念珠菌内转录间隔区和26S核糖体核糖核酸基因设计特异性引物和探针,构建含有上述基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,评价其特异性、灵敏度、重复性和稳定性。对1 185份临床标本中的白色念珠菌进行检测,同时进行真菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。对所有真菌分离株进行抗真菌药物敏感性试验。结果:研究结果显示,建立的白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法专属性强,能准确检出白色念珠菌,而与其他念珠菌属真菌、非念珠菌属真菌、细菌、寄生虫和病毒均无交叉反应,特异性为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测白色念珠菌DNA线性范围达11个数量级,白色念珠菌最低检测限度为5个菌落形成单位。该方法重复性非常好,组内和组间相对标准偏差均小于2%。测试中相关系数、斜率和效率没有显著变化,表明该方法稳定性好,精密度高。将其成功应用于临床标本中白色念珠菌载量的定量检测,用普通PCR和基因克隆测序分析进行了确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作定量分析快速诊断方法。应用TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应从1 185份临床标本中检出94份白色念珠菌阳性标本,真菌培养获得8株存活的白色念珠菌,抗真菌药物敏感性试验分析结果显示:这些白色念珠菌分离株对制霉菌素、咪康唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、沃尔康唑均敏感,但对两性霉素B、酮康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶已经产生了耐药性。结论:本研究新开发评价的TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应,可以快速简易,精准稳定,特异灵敏地定量检定白色念珠菌,适用于动物源性产品中白色念珠菌检测、食品药品生物制品医疗器械安全检查、环境监测、流行病学调查。