刺参26S蛋白酶体S7亚基基因的克隆与组织表达分析

应用RACE法从刺参Apostichopus japonicus体腔细胞中克隆出26S蛋白酶体组成19S亚复合体亚基之一的S7亚基基因(GenBank登录号:JQ922514)。该基因的cDNA序列全长为2 445 bp,其中5’UTR为70bp,3’UTR为1 070 bp,开放阅读框为1 305 bp,编码435个氨基酸;保守区具有典型的ATP结合和水解基序,氨基酸序列分别为GPPGTGKT和DEID,具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺参26S蛋白酶体S7亚基基因与紫海胆的氨基酸序列同源性最高(95%),与脊椎动物、节肢动物的同源性较高(88%~89%),与线虫、拟南芥和酵母同源性较低(85%、77%和73%);S7亚基编码的蛋白没有信号肽,也没有跨膜结构域,为非跨膜蛋白,定位于细胞中的液态基质中。采用实时定量PCR方法检测了26S蛋白酶体S7亚基基因在刺参5种组织中的表达情况,结果显示,在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中26S蛋白酶体S7基因均有明显表达,且体腔细胞中表达量最高,其次是纵肌和肠,在体壁和呼吸树中表达量较低。本研究中首次在刺参体内发现并克隆了26S蛋白酶体S7亚基基因,同时采用Realtime PCR技术对该基因的表达部位进行了研究,所得结果将为研究棘皮动物蛋白质代谢途径提供新的着眼点,为刺参生理功能的调控研究奠定了基础。

合浦珠母贝26S蛋白酶体S4,S7亚基基因片段的分离与分析

26S蛋白酶体是真核生物中一种具有ATP依赖性的蛋白酶复合体 ,主要通过泛肽途径选择性降解细胞内与代谢调控、细胞周期有关的功能蛋白及异常蛋白 ,参与多种细胞活动的调控过程。26S蛋白酶体由具有催化活性的20S亚复合体和一个具有调节作用的19S亚复合体组成 ,其中19S亚复合体中的ATP酶亚基是调节26S蛋白酶体活性的重要组件。本文通过简并引物PCR手段 ,从软体动物合浦珠母贝(Pinctadafucata)中扩增到参与构成19S亚复合体的S4和S7(MSS1)两个亚基的基因片段。这两个基因片段所编码的ATP酶组件包含有Gx4GKT,DEID ,SAT和H/QRxGRxxR等26S蛋白酶体ATP酶亚基的共同功能基序。这是首次在软体动物中报道26S蛋白酶体的ATP酶亚基基因序列 。

蛋白酶体20S亚基β8调控丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶通路对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究蛋白酶体20S亚基β8(PSMB8)对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过调控丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路发挥其作用。方法采用癌症基因组图谱数据库分析ccRCC与正常组织PSMB8 mRNA的表达水平,并通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色等方法进一步检测PSMB8在ccRCC组织和细胞中的表达情况。构建稳定过表达和敲减PSMB8的细胞株,分别采用CCK-8法和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭的能力。对PSMB8共表达基因进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析,Western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白的磷酸化水平,并加用ERK激动剂C16-PAF处理进行细胞功能学挽救实验。结果与正常组织比较,PSMB8 mRNA和蛋白在ccRCC组织中呈高表达(P均<0.001),且与临床患者的TNM分期显著相关(P<0.001);与阴性对照组比较,过表达PSMB8可以促进786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.021,P=0.039)、迁移和侵袭(P均<0.001),敲减PSMB8可以抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.022,P=0.005)、迁移和侵袭(P均<0.001);PSMB8共表达基因通路富集分析提示其可能与丝裂原活化蛋白激酶通路相关(P<0.001);敲减PSMB8后786-O和ACHN细胞MEK1/2(P=0.017,P=0.016)、ERK1/2(P=0.010,P=0.040)蛋白磷酸化水平及ERK下游因子c-Myc(P=0.043,P=0.038)、c-Fos(P=0.025,P=0.008)和CyclinD1(P=0.006,P=0.047)转录水平均下调;与ERK激动剂C16-PAF处理组比较,敲减PSMB8+C16-PAF组明显抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.003,P=0.002)、迁移和侵袭能力(P均<0.001)。结论PSMB8通过激活MEK/ERK信号通路从而促进ccRCC细胞的增殖、迁移及侵袭。

水稻杂种超亲表达26S蛋白酶体亚基基因OsHL1的克隆和分析

运用DDRT PCR分离获得水稻杂种一代超亲表达的cDNA片段。以此序列在日本晴cDNA全长数据库进行同源搜索 ,检索到一个功能未知的全长cDNA ,有 16 90bp,命名为OsHL1,进一步分析发现它位于 3号染色体上R2 393和MRG4 5 4 8之间。序列分析表明 ,该基因与日本晴编码 2 6Sproteasomeregulatoryparticlenon ATPasesubunit5基因片段的序列同源性为97%。其中包含一个完整的开放阅读框 (ORF) ,编码 4 4 3个氨基酸 ,氨基酸序列同源性分析发现高度保守区。RT PCR显示OsHL1基因的表达受到ABA和MeJA处理下调。推测杂种的表现可能与 2 6S蛋白酶体亚基参与的信号调控相关。

26S蛋白酶体LMP2亚基参与调节血管内皮细胞对氧化应激的耐受性形成

目的:观察在氧化应激耐受及氧化应激损伤的血管内皮细胞(VECs)26S蛋白酶体LMP2亚基的表达变化情况,并评价26S蛋白酶体LMP2亚基在调节VECs对氧化应激耐受性中的可能作用。方法:建立H2O2诱导氧化应激损伤及氧化应激预处理VECs模型;采用细胞免疫荧光标记联合Western blotting法检测26S蛋白酶体LMP2的表达;采用脂质体LipofectamineTM2000转染LMP2反义/正义寡核苷酸;检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性及丙二醛(MDA)的含量。结果:H2O2可剂量及时间依赖性地诱导VECs氧化应激损伤,培养上清中MDA浓度及LDH活性明显增加;H2O2(10μmol/L,24 h)预处理可诱导26S蛋白酶体LMP2亚基的高表达及细胞对H2O2(500μmol/L,3 h)诱导氧化应激的耐受,培养上清中MDA浓度及LDH活性明显减少;与H2O2(500μmol/L,3 h)处理组比较,采用干扰素γ(IFN-γ,20μg/L,48 h)可诱导VECs 26S蛋白酶体LMP2亚基高表达,也可诱导VECs对H2O2的耐受,其培养上清中MDA浓度及LDH活性明显降低,而转染LMP2-反义寡核苷酸可抑制IFN-γ诱导的培养上皮细胞26S蛋白酶体LMP2亚基高表达并阻断细胞对H2O2(500μmol/L,3 h)的耐受。结论:26S蛋白酶体LMP2亚基参与VECs对氧化应激耐受性的形成。

中国地鼠26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13的表达鉴定及生物信息学分析

目的鉴定26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13(PSMD13)在Ⅱ型糖尿病中国地鼠的表达及对其理化性质、信号肽、亚细胞定位、功能结构域等进行分析,为深入研究其功能提供理论依据。方法荧光定量PCR法检测PSMD13 mRNA在中国地鼠和糖尿病地鼠肝、骨骼肌、脂肪和小肠组织的表达;PSMD13氨基酸序列从NCBI网站下载,氨基酸同源性分析采用DNAman软件;PSMD13蛋白的理化性质分析采用Prot Param在线工具;PSMD13蛋白的亲疏水性、信号肽、亚细胞定位采用Prot Scale软件分析;PSMD13蛋白结构域、二级结构分别采用Conserved Domain数据库和SOPMA工具分析;PSMD13蛋白质的互作蛋白及功能网络采用STRING数据库分析。结果RT-qPCR结果显示PSMD13 mRNA在糖尿病地鼠脂肪组织中表达下降;PSMD13位于中国地鼠第3号染色体,含有13个外显子,相对分子质量为42942.48,含有378个氨基酸残基;PSMD13理论等电点为6.1,属酸性蛋白;其与小鼠、大鼠、果蝇、猩猩和人PSMD13的氨基酸序列同源性高达97.78%;PSMD13蛋白质无信号肽、无跨膜结构,主要位于细胞质中;PSMD13蛋白质羧基端含有一个PCI结构域,与PSMD7、PSMD8、PSMA3、PSMC1和USP14等相互作用,参与泛素依赖性蛋白质分解代谢过程。结论PSMD13在糖尿病中国地鼠脂肪组织中表达下降,该蛋白质在进化上高度保守,参与蛋白质的蛋白酶体降解途径,其表达下调可能参与糖尿病的发生发展。

一次大强度运动后大鼠骨骼肌收缩蛋白降解和26S蛋白酶体活性的变化

目的:探讨一次大强度运动对骨骼肌收缩蛋白降解和26S蛋白酶体活性的影响。方法:36只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组:安静对照组、运动0.5小时组、运动1小时组、运动1小时后1小时组、运动1小时后2小时组、运动1小时后6小时组,每组6只。运动方式采用一次大强度跑台运动,速度为25m/min,坡度为5%,运动时间分别为0.5小时和1小时。运动后按每组规定时间取材大鼠腓肠肌,观察其3-甲基组氨基酸(3-MH)含量、26S蛋白酶体活性和26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达的变化。结果:(1)运动(0.5小时和1小时)后即刻和运动1小时后6小时大鼠腓肠肌3-MH含量显著高于安静对照组(P<0.01),其中运动0.5小时即刻值最高。(2)运动0.5小时即刻、运动1小时后6小时大鼠腓肠肌26S蛋白酶体活性显著高于安静对照组(P<0.05)。(3)运动1小时后6小时大鼠腓肠肌26S蛋白酶体C2亚基mRNA表达显著高于安静对照组(P<0.01),其它时间点却低于安静对照组。结论:运动后26S蛋白酶体活性增高可能促使骨骼肌收缩蛋白降解增强,其活性受亚基基因调控。

热疗中热休克蛋白90对26S蛋白酶体的调控机制

目的探讨热疗中热休克蛋白90(HSP90)对26S蛋白酶体的调控机制。方法建立42℃热疗的Hep G2肝癌细胞系模型,评价不同热疗持续时间(0、3、6、12、24 h)对细胞内活性氧簇(ROS)和细胞增殖的影响;并对热疗导致Hsp90α和26S蛋白酶体的影响进行分析。结果热疗后细胞内ROS的含量增加(F=28.958,P<0.001),且热疗对细胞的增殖抑制程度随着时间的延长显著增强(F=621.704,P<0.001);热疗导致胞内Hsp90α表达量增加(F=27.403,P=0.035),26S蛋白酶体表达量明显降低(F=164.174,P<0.001),活性也下降(F=133.043,P<0.001);干扰HSP90α后,26S蛋白酶体也减少(F=180.231,P<0.001)。结论随着热疗时间延长,细胞内ROS含量增加,热应激和ROS共同导致蛋白持续变性而消耗HSP90,使没有足够的HSP90对26S蛋白酶体组装和稳定导而导致变性蛋白蓄积发生未折叠蛋白反应使细胞死亡。

泛素/26S蛋白酶体途径与显花植物自交不亲和反应

植物的生长和发育离不开短命调控蛋白的有选择性降解,其中一种重要的降解方式就是泛素/26S蛋白酶体途径。在这个途径中,泛素(ubiquitin)和26S蛋白酶体起着至关重要的作用,需要被降解的蛋白会通过E1-E2-E3酶接合反应由Ub进行标记,随后标记蛋白会被26S蛋白酶体识别并降解。自交不亲和反应也正是通过此途径实现的,ARC1(armrepeatcontaining1)和SCFs(skp1-cul1-F-box-proteins)作为E3s分别在孢子体自交不亲和和配子体自交不亲和反应中起作用。本文综述了就泛素/26S蛋白酶体途径的组成及其在自交不亲和反应中的作用。

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织20s蛋白酶体C_2亚基的基因及蛋白表达的研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子——泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达水平及意义。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定大鼠伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达。结果 RT-PCR结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达(IOD值)较对照组增加,差异有统计学意义(P<0.01);Westernblot结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达较对照组增强,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 COPD大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达均显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一。

泛素/26S蛋白酶体途径与植物的生长发育

泛素/26S蛋白酶体途径在植物蛋白降解系统中起重要作用,泛素分子主要通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)将靶蛋白泛素化,泛素化的蛋白最后被26S蛋白酶体识别和降解。泛素蛋白酶体途径参与植物体内的多种生理过程,如花和胚的发育、光形态建成、植物生长物质等几乎所有的生长发育过程,本文主要对泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育过程中的精确调控作用进行综述。

植物泛素/26S蛋白酶体途径研究进展

泛素/26S蛋白酶体途径是最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径,由泛素激活酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶和26S蛋白酶体组成,参与调控植物生长发育的多个方面。泛素蛋白酶体途径参与植物体内的众多生理过程,如植物激素信号、光形态建成、自交不亲和反应和细胞周期等。就泛素/26S蛋白酶体途径以及在植物生长发育中的作用的研究近况做一综述。

泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育中的功能

泛素/26S蛋白酶体途径是一种蛋白高效降解途径,主要负责真核细胞内蛋白的选择性降解。泛素分子主要通过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素-蛋白连接酶E3将靶蛋白泛素化,泛素化的蛋白最后被26S蛋白酶体识别和降解。本文介绍了泛素/26S蛋白体介导的特异性蛋白质降解途经,并对其在植物激素信号、光形态建成、植物衰老、自交不亲和反应、细胞周期调控、花的发育、生物钟节律和非生物胁迫响应中的功能最新研究进展进行了综述。

植物泛素/26S蛋白酶体通路的生理功能和分子生物学

介绍泛素/26S蛋白酶体通路的分子生物学研究最新进展,并对其同源异形性及在植物激素信号、抗病和衰老、光形态建成、植物逆境信号转导中的功能进行了讨论。

泛素/26S蛋白酶体途径调节非生物胁迫的研究进展

随着环境的恶化和资源的匮乏,非生物胁迫已成为制约植物生长和发育的重要因素,严重影响农作物的产量和农产品的品质。泛素/26S蛋白酶体途径(ubiquitin/26Sproteasome pathway,UPP)通过特异性地降解泛素化修饰的蛋白质,介导了植物生长发育的诸多方面,并在植物应对非生物胁迫过程中起关键的调控作用。该文主要概述了泛素/26S蛋白酶体途径及其调控植物响应非生物胁迫机制的研究进展。

大豆种子蛋白亚基及11S/7S随种子发育的变化规律

为促进大豆蛋白品质改良,采用SDS-PAGE凝胶电泳对4份不同大豆品种种子发育过程中的蛋白亚基变化规律进行了分析。结果表明,在种子发育过程中发现蛋白含量高的品种中吉601(44.82%)在S4时期β亚基积累明显高于其他蛋白含量低的品种;不同大豆品种的11S组分的亚基在各个时期的积累明显不同,11S/7S比值低的两个品种中吉601(1.059)和吉林小粒豆(1.022),其11S组分中的Basic亚基在S3-S9时期的含量低于其他亚基的含量,而11S/7S比值高的两个品种黑河23(1.324)和绥农28(1.401),其11S组分中的Basic亚基和Acidic亚基在S3-S9时期含量高于其他亚基的含量,推测不同品种的11S/7S比值高低与Basic亚基在种子发育过程中的积累相关。

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。

26S蛋白酶体参与人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元样细胞逐步分化过程中26S蛋白酶体的作用。方法:贴壁分离获得的hBMSCs先经β-巯基乙醇(β-ME)预诱导24h,随后用视黄酸(RA)诱导3d,最后再用生长因子(GF,10μg/LbFGF、20μg/LNGF)持续培养3d。免疫荧光染色观察不同诱导阶段神经前体细胞标志物nestin、早期神经元标志物Tuj1、成熟神经元标志物NF的表达。免疫荧光染色和RT-PCR分析不同诱导阶段26S蛋白酶体的表达变化。应用含26S蛋白酶体抑制剂的培养液(5μmol/LMG132、10μg/LbFGF、20μg/LNGF)作用于经β-ME/RA诱导后的细胞,NF免疫荧光染色观察蛋白酶体抑制剂对hBMSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:未诱导的hBMSCs几乎不表达nestin、Tuj1和NF;经β-ME/RA诱导后神经前体细胞标志物nestin和早期神经元标志物Tuj1表达率增高(34.41%±1.27%,27.79%±1.27%);经β-ME/RA/GF诱导后成熟神经元标志物NF表达率迅速升高(56.72%±2.40%)。免疫荧光染色和RT-PCR结果证实,未诱导hBMSCs26S蛋白酶体表达水平较低;经β-ME/RA诱导后个别细胞26S蛋白酶体染色增强,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.33倍;经β-ME/RA/GF诱导后26S蛋白酶体深染细胞增多,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.77倍。应用26S蛋白酶体抑制剂MG132后,NF阳性细胞表达率显著降低(37.59%±1.52%)。结论:hBMSCs在β-ME/RA/GF诱导下可逐步向神经元样细胞分化,26S蛋白酶体在诱导过程中表达水平逐步增高,26S蛋白酶体抑制剂能够抑制hBMSCs向成熟神经元分化,提示26S蛋白酶体可能参与诱导hBMSCs向神经元样细胞的成熟分化。

26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13基因多态性与强直性脊柱炎的关系

目的探讨26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13(PSMD13)基因多态性与强直性脊柱炎(AS)的关系。方法选择20例AS患者为AS组,20例健康体检者为对照组。采集所有研究对象的血液样本并提取DNA,扩增PSMD13基因rs1045288、rs28927679、rs1794108、rs1794109位点的DNA片段,分析两组间PSMD13基因不同位点等位基因和基因型分布频率。结果所有位点的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡定律。两组间PSMD13基因rs1045288位点的等位基因和基因型分布频率,以及rs28927679位点的等位基因分布频率比较,差异均有统计学意义(均P <0. 05);而两组PSMD13基因rs1794108位点和rs1794109位点的等位基因和基因型分布频率比较,差异均无统计学意义(均P> 0. 05)。结论 PSMD13基因rs1045288位点和rs28927679位点的多态性可能与AS发生相关。

葛根素治疗肺动脉高压大鼠的26S蛋白酶体变化研究

目的观察葛根素用药后大鼠肺组织蛋白质组学的变化并探讨葛根素抑制肺动脉高压、肺血管重建的机制。方法制备各组模型大鼠后分别测定平均肺动脉压力(mPAP)、平均颈动脉压力(mCAP)、右心室重量比RV/(LV+S)%,制作光镜标本、测量肺血管重建指标(PAMT)及统计学分析,明确模型制备成功。对各组肺动脉组织提出的总蛋白质进行双向电泳,串联质谱鉴定有差异的蛋白质及NCBInr数据库检索。对鉴定的蛋白质进行分析。结果在葛根素组,26S蛋白酶体较肺动脉高压组表达显著下降,可能与其抑制肺动脉高压机制有关。结论葛根素可通过26s蛋白酶体抑制肺动脉高压、肺血管重建与右心室肥大。