人工合成HDV抗原27肽的应用──血清抗HDV的检测

采用自行设计、选择含天然ＨＤＡｇ部分片段的人工合成２７肽建立ＥＩＡ检测抗ＨＤＶ方法，在国内８家医院检测各类人员中血清抗ＨＤＶ状况。ＨＤＶ抗原合成肽由中国科学院上海生物化学研究所合成。结果：献血员（３１５例），甲型肝炎（１１３例）和非乙型肝炎（１５４例）中２例阳性；在ＨＢＶ感染者中共检出抗ＨＤｖ（＋）为２ｌ５／１４８２（１４．５１％）。其中ＡｓＣ为１４／４１４（３．３８％）、ＡＨ为１１／７６（１４．４７％），ＣＰＨ为５／２８（１７．８６％）、ＣＡＨ为３２／１８１（１７．６８％）ＳＨ为１７／８６（１９．７７％），ＬＣ为５２／１４２（３６．６２％），ＰＨＣ为３０／１３０（２３．０８％），另５４／４２５（１２．７１％）未分型。同一单位抗ＨＤＶ的检出与已往用市售试剂结果基本一致，与Ａｂｂｏｔｔ试剂符合率为９４．９％（７４／７８）。提示本ＨＤＶ抗原２７肽具有ＨＤＶ抗原活性，能特异地为天然抗ＨＤＶ识别，可作为检测抗ＨＤＶ诊断试剂。

应用丁型肝炎病毒27肽抗原检测丁型肝炎病毒抗体

采用中科院上海生化所合成丁型肝炎病毒（ＨＯＶ）抗原２７肽酶联法，检测重庆地区乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者中血清丁型肝炎病毒抗体（抗－ＨＤ）结果：３００例献血员中１例阳性（此人ＡＬＴ较正常升高２倍）１１３例甲型肝炎、５８例非乙型肝炎均为阴性；ＨＢＶ标记阳性者８８２例中抗－ＨＤ（＋）１０６例（１２．０２％），其中乙型肝炎表面抗原携带者１３／４１０例（３．１７％）、急性肝炎１１／７６例（１４．４％）、慢性迁延性肝炎１／１３例（７．６９％）、慢性活动性肝炎２２／１２１例（１７．６８％）、重型肝炎１７／８６例（１９．７７％）、肝硬化２３／７８例（２９．４９％）、原发性肝细胞癌１９／９８例（１９．３９％）。结果与已往报告基本一致。与ＡｂｂｏｔｔＥＩＡ试剂相符率为７４／７８例（９４．９％）。采用天然丁型肝炎病毒抗原（ＨＯＡｇ）与之竞争抗－ＨＤ，４份阳性转为阴性，２份阴性结果不变，提示本ＨＤＶ抗原合成肽具有天然ＨＤＡｇ活性，可特异识别抗－ＨＤ，是一新的、稳定、安全、可靠的诊断用试剂。

G蛋白抑制性多肽-27药动学测定方法的建立

目的建立测定小鼠血浆中G蛋白抑制性多肽-27(GCIP-27)浓度的放射性核素(125I)示踪测定法。方法125I-GCIP采用Iodogen法标记,血浆中GCIP的浓度采用同位素示踪法结合三氯醋酸(TCA)沉淀法或低相对分子质量SDS-PAGE电泳法测定,并比较其测定结果。结果TCA沉淀法和电泳法同时对照测定60份GCIP血浆样品,结果呈良好的相关性,r=0.9554。2种方法最低检测浓度均为2.0μg.L-1,日内、日间RSD均小于10%,血浆在3.75～480μg.L-1内均呈良好的相关性,相关系数分别为r=0.9977和0.9964,血浆中GCIP的平均回收率分别为(92.72±4.55)%和(91.77±5.21)%。结论同位素示踪法与沉淀法或电泳法结合,方法稳定、可靠、灵敏度较高,两法相辅相成,适于GCIP-27血药浓度测定。

莲子光下萌发过程中光合膜超分子结构与27kD多肽变化

冰冻撕裂电镜观察及膜多肽组分的研究结果表明,随着莲子在光下萌发时间的延长,莲(Nelumbonucifera Gaertn.)胚芽叶的叶绿体光合膜的超分子结构发育与膜多肽组分中的27kD多肽含量变化具有明显的相关性:1.萌发2d后,胚芽叶的叶绿体巨基位变成解垛叠状态,其光合膜的超分子结构只呈现解垛叠类囊体区外质膜撕裂面(EF)和解垛叠类囊体的原生质膜撕裂面(PF)两个面;膜组分中主要是30kD多肽,而27kD多肽含量甚微。2.萌发4d后,光合膜从解垛叠开始转变成小基粒垛,垛叠区类囊体外质膜撕裂面(EFs)和垛叠类囊体的原生质膜撕裂面(PFs)开始发育;27kD多肽含量开始增加,30kD多肽含量开始减少。3.萌发6～8d后,光合膜明显分化出非垛叠膜区,非垛叠类囊体的外质膜撕裂面(EFu)和非垛叠类囊体的原生质膜撕裂面(PFu)开始呈现,EFs和PFs功能蛋白颗粒逐渐增多;27kD多肽逐渐增加,30kD多肽逐渐减少。4.萌发10～12d后,光合膜垛叠和非垛叠膜区分化完善,排列有序,EFs、PFs、EFu和PFu面功能蛋白颗粒的密度、大小、分布等超分子构象发育正常;27kD多肽更加增多,30kD多肽几乎消失。表明其超分子结构的发育动态既与其超微结构变化相一致,又与27kD多肽含量变化相吻合,却与一般高等植物的叶绿体发育相反。

小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因的鉴定与表达分析

从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定到一个泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因,命名为PsUBRS27a。该基因开放阅读框为480bp,编码包含159个氨基酸残基的蛋白质,其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin和Ribosomal_S27结构域;序列比对发现UBRS27a蛋白在不同物种中高度保守,但PsUBRS27a蛋白在进化上与柄锈菌属的UBRS27a蛋白亲缘关系最近;种内多态性分析发现PsUBRS27a基因在不同小麦条锈菌菌系中的序列非常保守,无核苷酸变化;实时荧光定量PCR结果表明,PsUBRS27a基因在条锈菌侵染小麦过程中呈上调表达趋势,高峰期为接种后168h。

单纯疱疹病毒2型感染细胞多肽27真核表达质粒的构建及表达

为了构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞多肽27(ICP27)真核表达质粒,应用PCR技术从HSV-2 333株的基因组中扩增ICP27基因,并连接至真核表达载体pEGFPC2,对阳性克隆进行菌落PCR、酶切和测序鉴定后,成功构建了重组质粒pEGFPC2-ICP27。用X fect转染试剂盒将重组质粒pEGFPC2-ICP27转染至Vero细胞中,并用RT-PCR及W estern b lot-ting检测其表达情况。结果显示,ICP27基因在Vero细胞中得到正确表达。真核表达质粒pEGFPC2-ICP27的构建成功,为进一步研究ICP27对宿主细胞的影响奠定了基础。

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin通过激活PI3K/Akt通路抑制HBV转基因小鼠特异性CTL凋亡

目的探讨胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制HBV转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)凋亡。方法 HBV转基因小鼠随机分组,100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin、50μg CTPHBcAg18-27-Tapasin、50μg CTP-HBcAg18-27及生理盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次。流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平及细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR表达的变化。结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.74±0.20)%,高于对照组50μg CTP-HBcAg-18-27-Tapasin(2.42±0.53)%及50μg CTP-HBcAg18-27(1.70±0.56)%和空白组(0.66±0.71)%(F=741.45,P=0.000);同时,100μg CTPHBcAg18-27-Tapasin融合蛋白有效抑制特异性CTL凋亡(6.29±0.02)%,低于对照组50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin(7.72±0.15)%及50μg CTP-HBcAg18-27(26.30±1.13)%和空白组(58.26±0.23)%(F=5313,P=0.000),并伴随凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR上调(F=52.61、18.32和94.18,P<0.05)。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin能有效诱导HBV转基因小鼠特异性CTL的表达,抑制其凋亡,机制与PI3K/Akt通路的激活有关。

泛肽、核糖体蛋白及泛肽-核糖体蛋白S27a与肿瘤的关系

泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,N端为泛肽,C端由含C2-C2型锌指结构域的高度保守核糖体蛋白S27a构成。在真核细胞中表达时,被酶解成泛肽和核糖体蛋白。该多功能核糖体蛋白在各种活性增殖细胞和瘤组织中高度表达,在多种类型的肿瘤细胞中,该基因的过量表达是一个典型特征。本实验室对该蛋白在家蚕中的作了初步研究,也发现RPS27a在活性增殖细胞中表达量很高。大多数核糖体蛋白的功能还没有完全探明,它们不仅仅在组装成核糖体时起作用,往往还有核糖体外的功能。回顾了最近几年有关该融合蛋白以及与它相关的泛肽途径、核糖体蛋白与肿瘤之间的关系。通过对它们的研究,有可能预示肿瘤的发生和发展,并为肿瘤临床诊断提供依据,为恶性肿瘤的治疗提供靶点。

模拟肽Gap27抑制缝隙连接蛋白43在帕金森病小鼠模型中的作用

目的:探索在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)小鼠模型中,应用缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)选择性抑制剂模拟肽Gap27能否改善多巴胺神经元死亡以及对Cx43表达的影响。方法:将18只C57BL/6小鼠随机分为对照组、6-OHDA组与6-OHDA+Gap27组,每组6只,进行双侧黑质脑立体定位注射。对照组注射抗坏血酸盐溶液,6-OHDA组注射6-OHDA溶液,6-OHDA+Gap27组注射6-OHDA和Gap27混合溶液,用免疫组织化学法对多巴胺神经元标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)染色检测多巴胺神经元数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测Cx43信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表达,免疫荧光染色检测Cx43蛋白分布,Western blot法检测小鼠中脑Cx43蛋白及Cx43的第368位点丝氨酸磷酸化(Cx43 phosphorylation at serine 368,Cx43-ps368)蛋白含量。结果:注射6-OHDA后,小鼠出现黑质多巴胺神经元大量死亡,6-OHDA组TH阳性神经元数量降为对照组的27.7%±0.02%(P<0.01),模拟肽Gap27的使用减少了多巴胺神经元死亡数量,6-OHDA+Gap27组TH阳性神经元数量为6-OHDA组的(1.64±0.16)倍(P<0.05);此外,6-OHDA引起Cx43蛋白含量增加,Cx43-ps368蛋白含量降低。Gap27减弱了6-OHDA引起的Cx43蛋白与Cx43-ps368蛋白含量变化,6-OHDA组中脑总Cx43蛋白含量为6-OHDA+Gap27组的(1.44±0.07)倍(P<0.05),为对照组的(1.68±0.07)倍(P<0.01),且6-OHDA组Cx43-ps368蛋白含量及占总Cx43蛋白比例显著低于6-OHDA+Gap27组(P<0.05)。结论:模拟肽Gap27在6-OHDA诱导的小鼠模型中可减少黑质多巴胺神经元死亡从而发挥神经保护作用,6-OHDA引起的Cx43蛋白过表达对多巴胺神经元可能存在神经毒性,而降低Cx43蛋白水平及维持Cx43-ps368蛋白水平可能是Gap27发挥保护作用的机制。

神经肽PACAP27抑制线粒体依赖性细胞凋亡途径对环磷酰胺所致大鼠睾丸损伤的改善作用

目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP) 27对环磷酰胺所致大鼠睾丸损伤的作用,阐明其可能机制。方法:60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、PACAP27组和左卡尼汀组,每组15只;除对照组外,其余各组大鼠采用环磷酰胺造模并给药。给药结束后第3天,称量大鼠体质量和睾丸质量,计算睾丸指数;采用放射免疫法检测各组大鼠血清中促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和睾酮(T)水平,HE染色观察各组大鼠睾丸组织病理形态表现,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组大鼠睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)水平,TUNEL染色检测各组大鼠睾丸组织细胞凋亡率,Western blotting法检测各组大鼠睾丸组织中线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平;提取睾丸组织线粒体,采用线粒体分离试剂检测各组大鼠睾丸组织中线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放程度,JC-1荧光染色检测各组大鼠睾丸组织线粒体膜电位。结果:与对照组比较,模型组大鼠体质量、睾丸质量和睾丸指数均降低(P<0.05),血清中FSH、LH和T水平降低(P<0.05),睾丸组织中SOD和CAT活性降低(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05),睾丸组织发生明显病理损伤,细胞凋亡率升高(P<0.05),睾丸组织中细胞色素C(Cyt C)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 (caspase-9)蛋白表达水平升高(P<0.05),B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平降低(P<0.05),mPTP开放程度增强(P<0.05),线粒体膜电位降低(P<0.05)。与模型组比较,PACAP27组和左卡尼汀组大鼠睾丸质量和睾丸指数均升高(P<0.05),血清中FSH、LH和T水平升高(P<0.05),睾丸组织中SOD和CAT活性升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05),睾丸组织病理损伤得到改善,细胞凋亡率降低(P<0.05),睾丸组织中Cyt C、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05),mPTP开放程度降低(P<0.05),线粒体膜电位升高(P<0.05)。结论:PACAP27可能通过抑制线粒体依赖性细胞凋亡途径减轻环磷酰胺所致大鼠睾丸损伤。

miR-34a-3p、DDX27在结直肠癌组织中的表达水平及临床意义

目的:检测结直肠癌患者组织中微小RNA-34a-3p(miR-34a-3p)、DEAD盒多肽27(DDX27)的表达水平,并探讨二者表达水平与结直肠癌预后的相关性。方法:选取2016年01月至2017年04月于本院住院的102例结直肠癌癌组织作为结直肠癌组,选取其癌旁正常组织作为癌旁对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测组织miR-34a-3p、DDX27 mRNA表达水平;分析结直肠癌患者组织中miR-34a-3p、DDX27 mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系;Kaplan-Meier法分析结直肠癌组织中miR-34a-3p、DDX27表达水平与患者生存率的相关性;多因素Cox回归分析影响结直肠癌预后的因素。结果:Targetscan网站在线预测结果显示miR-34a-3p与DDX27的3’UTR之间存在碱基互补关系。双荧光素酶实验结果显示,与miR-NC相比,miR-34a-3p-mimics与野生型3’UTR区(WT-DDX27)共转出现了荧光减弱,而与突变3’UTR区(MUT-DDX27)共转后荧光强度未出现明显变化;Ualcan数据库中,结肠癌组织中DDX27水平高于正常结肠组织(P <0.05);结直肠癌组DDX27 mRNA水平高于癌旁对照组,miR-34a-3p水平低于癌旁对照组(P <0.05),且DDX27表达趋势与Ualcan数据库一致;miR-34a-3p、DDX27表达与肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P <0.05);miR-34a-3p低表达组三年内存活率(64.00%)低于高表达组(94.23%),DDX27高表达组三年内存活率(66.67%)低于低表达组(92.16%),差异均有统计学意义(P <0.05);DDX27、组织分化程度、TNM分期是影响结直肠癌不良预后的独立危险因素(P <0.05),miR-34a-3p是影响结直肠癌不良预后的保护因素(P <0.05)。结论:结直肠癌组织中miR-34a-3p、DDX27表达水平与组织分化程度、TNM分期等临床病理特征密切相关,且均是影响结直肠癌预后的因素,可对结直肠癌的病情评价及治疗提供一定理论依据。

HSV-2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)多功能蛋白感染细胞多肽27(ICP27)真核表达载体pCDNA3.0-ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。方法提取病毒株HSV-2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0-ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero细胞,经RT-PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果 pCDNA3.0-ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT-PCR和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV-2多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0-ICP27,并能在Vero细胞中表达。

cGHRH_(1-27NH2)可作为家鸡生长激素释放激素受体的配体

家鸡生长激素释放激素(GHRH)的成熟肽段区存在一个酰胺化位点,提示具27个氨基酸残基的羧基端酰胺化多肽(cGHRH_(1-27NH2))可作为家鸡生长激素释放激素受体(GHRHR)的配体.为验证该假说,利用pGL3-CRE报告基因系统,在培养的中国仓鼠卵巢细胞中,探究人工合成cGHRH_(1-27NH2)多肽对家鸡两个GHRH受体的激活潜能.结果显示:cGHRH_(1-27NH2)可高效激活家鸡两个GHRH受体,并且该多肽对GHRH一型受体(cGHRHR_1:EC_(50):0.18 nmol/L)的激活效能略高于其对GHRH二型受体(cGHRHR_2:EC_(50):0.32 nmol/L)的激活效能.这些研究结果清楚表明GHRH_(1-27NH2)可作为家鸡两个GHRH受体的配体.