地衣芽孢杆菌2709和6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参

利用2709碱性蛋白酶水解酪蛋白制备CPPs的研究

酪蛋白磷酸肽简称CPPs(Casein phosphopeptides)，是一种具有多种生物活性的多肽。国外已经对其制备方法进行了大量研究，但是目前用于工业化生产的主要还是用胰蛋白酶水解酪蛋白或β-酪蛋白来获得。但是胰蛋白酶价格比较昂贵，用其进行工业化生产必定增加成本。本项研究改用价格十分廉价的2709碱性蛋白酶水解酪蛋白得到了和胰蛋白酶水解酪蛋白同样的产品，实验结果表明利用2709碱性蛋白酶水解酪蛋白制备CPPs可以大大降低成本。

2709碱性蛋白酶水解脱铬革屑的研究

研究了采用2709碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解产物时,影响胶原水解率的各种因素。研究表明,最佳水解条件为:酶量0.12%,pH10.0,温度50℃,时间40min。在此条件下,胶原的平均水解率为62.9%。同时测定了最佳水解条件下所得胶原水解产物的理化特性。

2709碱性蛋白酶水解BSA蛋白肽谱变化的研究

以2709碱性蛋白酶酶解牛血清白蛋白为研究对象,采用液相色谱-飞行时间质谱联用分析方法和位点非特异性酶切肽谱鉴定方法,分析水解过程中肽谱的动态变化。蛋白电泳分析结果显示,2709碱性蛋白酶在0.1%的添加比例条件下,0.5 h内可将全部蛋白降解,表明其具有极强的水解能力。肽谱分析结果显示,该酶酶解BSA蛋白过程中肽谱变化复杂多样,不同序列多肽具有不同的动态变化特征。酶切位点分析结果显示,2709碱性蛋白酶几乎能在所有种类的氨基酸位点发生酶切,但酶切的频率并不相同,这表明该酶在水解位点上具有宽泛的选择性和一定的倾向性,其中在肽键C端氨基酸种类的选择上具有明显的亮氨酸倾向性。该文可为研究其他工业蛋白酶水解肽谱的规律提供借鉴,并有助于提高我国工业蛋白酶制剂的应用水平和蛋白质加工水平。

2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜制备肝素工艺条件优化研究

为了研究2709碱性蛋白酶水解猪肠黏膜制备肝素工艺条件,在单因素试验基础上,利用Box-Benken进行试验设计,对水解条件进行了优化研究和验证试验。结果表明,2709碱性蛋白酶水解条件为酶底物质量分数0.70%,水解温度55℃,水解时间3 h,pH值8.8,食盐浓度0.3 mol/L,料液比为1∶7(g∶L);验证试验证明该水解条件是可靠的。

原生质体融合构建高产碱性蛋白酶工程菌

用原生质体融合的方法 ,将碱性蛋白酶生产菌 2 70 9与含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2 的工程菌枯草杆菌BD10 5进行细胞融合 ,得到 1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16 .菌落的原位杂交表明 ,该菌株携有双亲的遗传物质 .A16的表型与生长特征与 2 70 9相似 ,但同样条件下发酵酶活比 2 70 9高 5 0 %～ 10 0 % ,摇瓶发酵的产酶水平最高可达 300 0 0u/mL .A16发酵所产酶的最适pH与耐温性及发酵条件等特征均与 2 70 9相同 ,适用于工业生产 .图 3表 5参 2

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶2709的纯化与性质鉴定

本文报导了目前国内酶制剂工业的主要产品——地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的纯化方法的建立,并从蛋白质工程的需要对2709蛋白酶进行了酶学性质的研究。结果表明,2709蛋白酶具有比活高,热稳定性好,耐碱能力较强等优点。因此地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)2709是一个极具有遗传工程改造潜力的优良菌株,将成为新的蛋白质工程材抖。

高产碱性蛋白酶工程菌的构建及鉴定

利用原生质体融合技术 ,使碱性蛋白酶生产菌 2 70 9与枯草杆菌BD1 0 5(含有碱性蛋白酶基因克隆载体 pDW 2 )杂交 ,得到 1株高产碱性蛋白酶的工程菌A1 6.A1 6的表型与生长特征与 2 70 9相似 ,相同条件下发酵酶活性比 2 70 9菌株高5 0 % ,摇瓶发酵的产酶水平最高可达 30 0 0 0u/mL .用菌落的原位杂交鉴定出该菌株携有双亲的遗传物质 .

天然有机物对碱性蛋白酶活力的影响

探讨了两种不同天然有机物对2709碱性蛋白酶活力的影响,采用福林法测定了该蛋白酶的最适作用条件.分别考察了不同浓度的天然有机物T、天然有机物S及这两种有机物的共同作用对2709碱性蛋白酶活力的影响.结果表明:T、S及T和S的协同作用对酶活均有不同程度的激活,其中提高酶活最显著的是天然有机物T和S共同作用于蛋白酶的混合体系.

两种天然有机物对碱性蛋白酶活力和热稳定性的影响

探讨了2种不同天然有机物对2709碱性蛋白酶的活力和热稳定性的影响。采用福林法测定了该蛋白酶的最适作用条件,分别考察了天然有机物H和K对2709碱性蛋白酶活力和半寿期的影响。试验结果显示:天然有机物H和K对碱性蛋白酶的活力均有一定程度的提高,同时对酶的半寿期也有一定的延长,对酶液具有较好的保护作用。

两种天然有机物对碱性蛋白酶活力的影响

探讨了两种不同天然有机物对2709碱性蛋白酶活力的影响,采用Folin法测定了该蛋白酶的最适作用条件。较系统地分别考察了不同浓度的天然有机物F、天然有机物C及这两种有机物共同作用于2709碱性蛋白酶对活力的影响。结果表明对酶活均有不同程度的激活,其中提高酶活最显著的是天然有机物F和C共同作用于蛋白酶的混合体系。

2种蛋白酶对柞蚕茧的脱胶工艺条件及脱胶效果

蚕茧采用酶脱胶的方法对茧丝的损伤小,且有利于丝胶蛋白回收和减轻环境污染。为了推进酶脱胶方法在柞蚕茧缫丝生产中的应用,分别用2709碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶对柞蚕茧脱胶,通过控制温度、时间和酶用量,探究适合柞蚕茧脱胶的酶种类以及工艺条件。结果表明,柞蚕茧进行丝胶膨润、软化前处理后,在酶质量浓度为4 g/L、温度45℃、pH 10,浴比1∶25、酶解时间150 min的条件下,2709碱性蛋白酶对柞蚕茧的脱胶率达到10%左右;柞蚕茧经真空渗透前处理后,在酶质量浓度为6 g/L,温度70℃、pH 7、浴比1∶25、酶解时间90 min的条件下,中性木瓜蛋白酶对柞蚕茧的脱胶率也达到10%左右。2种蛋白酶对柞蚕茧均有较好的脱胶效果。用扫描电子显微镜观察酶脱胶后缫制的柞蚕丝形貌,可见其表面较为光滑,茧丝的损伤程度明显小于传统的碱法脱胶对茧丝的损伤,且中性木瓜蛋白酶脱胶对茧丝的损伤小于2709碱性蛋白酶脱胶对茧丝的损伤。

生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(CPP)的研制

摸索了 2 70 9碱性蛋白酶水解酪蛋白制备CPP的最佳工艺条件 :底物浓度 1 0 %、用酶量 1 50 0U/g底物、反应温度 45℃、pH1 0 5、反应时间 1 50min。采用选择淀淀法分离CPP ,在pH 4 .5添加 1 1 %CaCl2 (w/v)和50 % (v/v)乙醇 ,室温沉淀 4h,得到CPP产品的N/P、得率分别为 6 39和 1 3 94%。

优化蛋清粉蛋白热变性条件的研究

为了降低蛋清粉蛋白高F值寡肽的生产成本以实现工业化大规模生产,本实验利用了对比分析和L9(34)正交试验设计方法,考察热变性时间、热变性温度和加酶量三个因素对蛋清粉蛋白水解度的影响,优化出蛋清粉蛋白热变性条件的最佳参数为:当底物浓度为5%,热处理温度90℃,热处理时间10min,碱性蛋白酶加酶量5%,酶解5h后蛋清粉蛋白水解度为26.68%。

生物活性肽-酪蛋白磷酸肽(CPP)的研制

摸索了 2709碱性蛋白酶水解酪蛋白制备 CPP的最佳工艺条件：底物浓度 10％、用酶量 1500μ /g反应温度 45℃、 pH10.5、反应时间 150min。采用选择沉淀法分离 CPP，在 pH4.5添加 1.1％ CaCl 2（ w/v）和 50％（ v/v）乙醇，室温沉淀 4h，得到 CPP产品的 N/P、得率分别为 6.39％和 13.94％。

用2709碱性蛋白酶水解醇洗花生蛋白制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽

采用2709碱性蛋白酶水解醇洗花生蛋白制备ACE抑制肽。以短肽得率、水解度和ACE抑制率为指标,通过单因素和响应面优化设计获得最佳酶解工艺条件:p H 9.3、酶解温度50℃、时间150 min、加酶量3 000 U/g和底物浓度4%,在最佳酶解条件下,短肽得率为77.89%,水解度为17.87%,ACE抑制率为76.26%。结果表明:适当的酶解时间和温度能提高短肽得率和ACE抑制率,但酶解时间过长,过度水解会使短肽失去ACE抑制结构,降低ACE抑制率。

不同脱胶方法对蚕丝性能的影响分析

周小进／苏州市纤维检验所／《针织工业》2013（4）／采用碳酸钠、中性皂、酒石酸、2709碱性蛋白酶和高温高压水脱胶法对蚕丝分别进行脱胶处理，对比分析了不同方法处理后蚕丝的脱胶率、力学性能、白度、红外光谱曲线及染色性能。结果表明：蚕丝经不同脱胶方法脱胶一次后，丝胶蛋白即可基本去除，脱胶率保持在23％-24％；蚕丝的断裂强度、断裂伸长率、断裂功经不同脱胶方法脱胶后均有一定程度的下降，高温高压水脱胶对蚕丝的力学性能影响最大；不同脱胶方法后蚕丝白度均有不同程度的改善，