28醇对6-羟基多巴胺致帕金森病大鼠模型行为学的改善作用

目的检测28醇对6-羟基多巴胺(6-OHDA)致帕金森病(PD)大鼠模型的作用。方法将大鼠分为假手术组(n=15)、模型组(n=15)、低剂量组(n=12)、中剂量组(n=12)和高剂量组(n=12)。将6-OHDA注入大鼠右侧纹状体制备PD模型,治疗组分别以28醇17.5 mg/kg、35 mg/kg、70 mg/kg灌胃。给药2周后行阿扑吗啡诱导旋转实验、Morris水迷宫、平衡杆实验。结果中高剂量组30 min内旋转圈数少于模型组(P<0.05),寻台时间短于模型组(P<0.05);各治疗组潜伏期和过杆时间明显短于模型组(P<0.01)。结论 28醇可以提高PD模型大鼠的四肢协调及运动能力、运动始动性和运动平衡能力,有效对抗多巴胺神经损伤造成的行为障碍。

双波长薄层扫描法测定双降胶囊中a-香树脂醇的含量

采用双波长薄层扫描法测定双降胶囊中α香树脂醇的含量。本法测定准确，专属性强。平均回收率为１０１５０％ ，ＲＳＤ 为３１７％ （ｎ＝ ４）。

β-香树脂醇对水稻纹枯病菌的抑菌作用

[目的]探究β-香树脂醇对水稻纹枯病菌的抑菌活性及其作用机制,为植物源农药的开发提供参考。[方法]采用菌丝生长速率法测定β-香树脂醇对水稻纹枯病菌的抑菌活性,比较不同质量浓度β-香树脂醇对水稻纹枯病菌菌丝干质量的影响,并测定β-香树脂醇处理后水稻纹枯病菌的MDA和还原糖含量以及活性氧清除酶活性等生理生化指标,以相同溶解条件的甲醇—乙醇混合液为对照。[结果]β-香树脂醇对水稻纹枯病菌具有较强的抑菌活性,其抑制中浓度为120.801μg·mL。与对照相比,经β-香树脂醇处理后的水稻纹枯病菌菌丝干质量减少、细胞膜MDA含量明显上升、还原糖含量减少,活性氧清除酶(CAT、POD、SOD)活性随处理时间延长呈“倒V”型变化趋势。[结论]β-香树脂醇对水稻纹枯病菌具有抑制作用,其作用机制是通过诱导质膜发生过氧化,破坏细胞膜结构,提高细胞内活性氧含量及活性氧清除酶活性,从而抑制水稻纹枯病菌菌丝生长。

刺五加β-香树脂醇合酶基因的挖掘及功能验证

目的 刺五加三萜皂苷是我国传统中药刺五加的主要活性成分之一,具有抗炎、抗癌、抗疲劳、抗氧化等多种功效。但由于刺五加自然资源缺乏,难以满足对三萜皂苷的需求,急需寻求可持续资源利用新模式。目前,生物合成已成为植物次生代谢物积累的重要途径,为此,探寻出刺五加三萜皂苷的生物合成途径具有重要意义。方法 本文通过同源搜索和系统发育分析,预测并克隆了刺五加三萜皂苷合成途径中关键基因EsOSC5,并通过农杆菌介导的烟草瞬时表达实验,获得代谢产物;利用GC-MS检测其次生代谢产物并确定EsOSC5基因功能。结果 挖掘并克隆出片段大小为2286 bp的EsOSC5基因;EsOSC5基因转化烟草的瞬时表达实验及GC-MS次生代谢产物检测数据表明,β-香树脂醇为该基因的代谢产物。结论EsOSC5基因可促进刺五加β-香树脂醇(三萜皂苷前体)的合成积累,该基因为刺五加β-香树脂醇合酶基因。

人体肠道菌生物转化亚麻木酚素产生4,4′-二羟基肠二醇的条件研究

利用笔者前期工作中分离得到的两株细菌单形拟杆菌ZL-Ⅰ和黏液真杆菌ZL-Ⅱ对亚麻子粕中的木脂素类成分进行生物转化获取中间体4,4′-二羟基肠二醇,并对其发酵工艺进行了研究。研究结果表明,经过24h的发酵培养,亚麻子粕中的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷转化为4,4′-二羟基肠二醇的转化率为59%,发酵培养6d后,转化率达到94.4%。XAD-2大孔吸附树脂可对发酵液中的4,4′-二羟基肠二醇进行富集,30%乙醇洗脱液中4,4′-二羟基肠二醇的质量分数为(317±33)mg/g。

甘草过表达HMGR、SQS1、β-AS基因再生植株的诱导

目的:诱导过表达3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)、鲨烯合成酶1(SQS1)和β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因的甘草再生植株。方法:以植物双元表达载体pCAMBIA1305.1为载体骨架,HMGR、SQS1、β-AS基因为目的基因,利用基因重组试剂盒eFusion CloningKit分别构建含有3个外源基因的重组载体,并将其转入根癌农杆菌EHA105,采用根癌农杆菌介导法将目的基因转入甘草外植体。结果与结论:获得了过表达HMGR、SQS1和β-AS基因的甘草愈伤组织及试管苗,为进一步研究这3个功能基因过表达对甘草酸合成的影响奠定了基础。

气相色谱-质谱法结合气相色谱法鉴别山茶籽油真实属性

该研究旨在建立一种GC-MS结合GC对掺假山茶籽油进行定性鉴别的方法。该实验基于GC-MS法检测植物油中β-香树脂醇的含量,以实现样品的批量初筛,再结合GC法检测其中油酸与亚油酸的含量进行确证,实现山茶籽油掺假的定性鉴别。结果表明,β-香树脂醇的测定出峰较快、检测周期短、线性关系良好。该方法在低、中、高水平的加标回收率为82.6%~111.5%,相对标准偏差均低于5.36%,可实现植物油样品的批量初筛。结合GC检测其脂肪酸含量进行确证,油酸和亚油酸含量可作为山茶籽油掺假的鉴别指标。该方法可实现山茶籽油中掺入一种或其他几种植物油(花生油、玉米油、菜籽油与大豆油)的定性鉴别,其掺假判定限为10%。

PjFPS和Pjβ-AS双基因协同作用对珠子参皂苷生物合成的影响

法尼基焦磷酸合酶(PjFPS)和β-香树脂醇合酶(Pjβ-AS)是珠子参皂苷(Panax japonicus saponins,PJS)生物合成途径中可能的关键酶。通过在珠子参(P.japonicus)细胞中同时过表达PjFPS和Pjβ-AS基因,探讨PjFPS和Pjβ-AS对PJS生物合成的协同作用。结果表明,PjFPS和Pjβ-AS是PJS生物合成途径中的关键酶基因,对珠子参皂苷的生物合成具有调节作用。过表达PjFPS和Pjβ-AS的细胞系中,PJS合成途径相关的多个关键酶基因的表达水平有不同程度的提高,且PJS的含量最高为普通细胞系的2.4倍。虽然单独过表达PjFPS也可增加PJS的合成,但双基因(PjFPS和Pjβ-AS)协同调控PJS合成的效果更好。

甘草鲨烯合酶1基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对β-香树脂醇积累的影响研究(英文)

甘草是我国最常用的大宗药材之一。甘草中最主要的活性成分为甘草酸,其生物合成途径受到很多酶的调节。鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)及β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)是其中的两种关键酶。为了揭示鲨烯合酶基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对MVA代谢途径的影响,本文构建了7种载体,分别含有3种不同的SQS1基因和β-AS基因,将其在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达,通过TLC及GC-MS检测代谢产物β-香树脂醇的含量。结果显示SQS1基因与β-AS基因共表达有助于代谢产物β-香树脂醇的积累,在3种不同的SQS1基因中,以SQS12为最好。本文为进一步研究功能基因对甘草酸代谢途径的影响以及提高甘草酸的含量奠定了理论基础。

基于β-香树脂醇合成酶基因SNP的甘草道地性机制研究

本文采用PCR-SSCP和测序组合技术检测了6个产地甘草的β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因的SNP,并进行了SNP和产地的相关性分析,探索甘草道地性形成的分子机制。结果显示,甘草β-AS基因第一外显子存在1处SNP,可将甘草划分为94A型、94G型和94A/G型3种基因型,其中94A型在道地产区所占比例要远远高于非道地产区,达到极显著差异(P<0.001)。本文研究证明,甘草β-AS基因94位点的SNP可能是导致甘草道地性形成的机制之一。

酿酒酵母细胞中β-香树脂醇代谢流调控的研究

该研究通过使用CRISPR/CAS9基因编辑技术,成功在实验室前期保存的产β-香树脂醇酿酒酵母细胞中敲除编码胞质苹果酸合成酶(citrate synthase,CIT2)和过氧化物酶体柠檬酸合酶(malate synthase,MLS1)的CIT2和MLS1基因,并将编码磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI1)的PGI1基因启动子替换成编码酵母线粒体蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅶa(cytochrome c oxidase subunitⅦa)的核基因Cox9的启动子,从而弱化PGI1基因的表达,调节乙酰辅酶A和胞内NADPH供给,进而调控β-香树脂醇的产量。发酵实验结果表明,删除CIT2基因对β-香树脂醇的产量没有影响;删除MLS1基因后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的1.85倍,达到了3.3 mg·L^-1。弱化PGI1基因表达后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的3.75倍,达6.7 mg·L^-1。该研究通过使用CRISPR/CAS9基因敲除技术成功的敲除CIT2和MLS1基因并弱化PGI1基因,提高了β-香树脂醇的产量,也为后期研究β-香树脂醇的酵母异源合成提供一定的借鉴意义。

产β-香树脂醇酿酒酵母细胞构建及高密度发酵

该研究通过异源表达甘草来源β-香树脂醇合成酶(β-AS),成功在实验室前期保存的酿酒酵母底盘细胞中构β-香树脂醇的合成途径,实现了利用酿酒酵母生产β-香树脂醇,发酵质量浓度达5.97 mg·L^(-1)。通过进一步过表达酵母MVA途径的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19),甲羟戊酸激酶基因(ERG12),3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶基因(ERG13),磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)和异戊烯二磷酸酯异构酶基因(IDI1),促进酵母代谢流走向β-香树脂醇合成方向,最终成功获得Y2-C2-4工程菌株,将β-香树脂醇浓度提高一倍,达到10.3 mg·L^(-1)。通过高密度发酵策略,该菌株其β-香树脂醇的产量可达到157.4 mg·L^(-1),相对于原始菌株提高了26倍,为公开报道基因工程酵母合成β-香树脂醇的较高产量。该研究不仅为β-香树脂醇生物合成奠定了基础,也为后期研究细胞色素氧化酶及糖基转移酶的挖掘提供优势底盘菌株。

川续断β-香树脂醇合酶的基因克隆及生物信息学分析

续断是我国常用中药材之一,药用历史悠久,具有补肝肾、强筋骨、续折伤等功效。三萜皂苷类化合物是川续断科植物川续断的主要药效成分。β-香树脂醇合酶(β-AS)属于氧化角鲨烯环化酶(OSCs)超家族,在生物合成途径中具有催化齐墩果烷型三萜皂苷骨架形成的功能。目前有关川续断β-香树脂醇合酶的研究较少,其催化机制仍待探究。为进一步挖掘与丰富该类酶的信息,该研究通过对转录组测序结果进行分析,从川续断中克隆得到1个β-香树脂醇合酶基因DaWβ-AS,并构建至大肠杆菌载体中实现蛋白表达;并采用实时荧光定量PCR技术分析其在川续断4个不同组织中的相对表达量,结果显示DaWβ-AS基因在叶中的相对表达量最高。生物信息学分析表明,DaWβ-AS蛋白含有PLN03012保守结构域,属于cl31551超家族,无跨膜区且不含信号肽。通过对川续断β-AS的克隆、表达及生物信息学分析,为川续断三萜皂苷生物途径解析提供了科学依据,有助于推动后期川续断三萜皂苷的定向生物合成,并为高质量川续断资源培育与开发提供相关参考。

绞股蓝β-香树脂醇合酶基因的克隆和序列分析

为克隆绞股蓝的β-香树脂醇合酶基因(β-amyrin synthase,bAS),探讨绞股蓝bAS的性质特征及其与绞股蓝三萜生物合成及调控的可能关系。本研究根据绞股蓝转录组测序的结果设计合成bAS全长扩增引物,采用RT-PCR技术扩增绞股蓝bAS的开放阅读框架(open reading frame,ORF)全长序列并连接克隆载体进行测序,利用ExPASy等在线工具及MEGA-X软件对测序结果做相应的生物信息分析。测序结果显示绞股蓝bAS的cDNA的ORF全长共2 283 bp,编码760个氨基酸。该序列信息已提交GenBank,登录号为GM251742。对绞股蓝bAS的氨基酸序列进行了性质与结构预测和系统发育分析。bAS的全长cDNA序列的成功克隆,为绞股蓝bAS基因结构与功能研究提供了基础,并可为研究绞股蓝三萜合成通路的调节方式提供新的认识。

北柴胡β-香树脂醇合酶基因家族成员鉴定及功能验证

目的从转录组层面对北柴胡Bupleurum chinenseβ-香树脂醇合酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因家族成员进行鉴定,并对其表达及功能进行分析验证,以期为解析柴胡皂苷的合成和调控提供基础。方法基于全长转录组数据挖掘北柴胡β-AS基因家族成员(BcBASs),利用在线软件对各基因进行生物信息学分析,利用大肠杆菌和烟草验证关键基因的功能。结果从北柴胡转录组数据中挖掘到不冗余的β-AS基因6个,可分为3个亚家族,它们都具有典型保守区域DCTAE、MWCYCR和QW。进化分析表明,BcBAS1、BcBAS2、BcBAS4、BcBAS5、BcBAS6可能为单功能β-AS基因,BcBAS3可能为多功能β-AS基因,表达分析表明各基因在根和叶中的表达模式有差异。在大肠杆菌中成功表达了BcBAS1可溶性重组蛋白,相对分子质量约87000,烟草瞬时表达表明BcBAS1编码蛋白具有β-AS功能,能促进β-香树脂醇的积累。结论对北柴胡中6个不冗余的β-AS基因家族成员进行了鉴定和生物信息学分析,获得了Bc BAS1可溶性重组蛋白,在烟草中验证了BcBAS1为有功能的β-AS,为柴胡皂苷合成调控机制和生物合成研究奠定了基础。

尾叶香茶菜三萜类化学成分研究

为了研究尾叶香茶菜乙酸乙酯提取物的化学成分,本文采用十八烷基键合硅胶(octadecyl binded silica gel,ODS)柱色谱和制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)方法对尾叶香茶菜乙酸乙酯提取物进行分离,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。研究结果表明,从尾叶香茶菜乙酸乙酯提取物中分离得到7个三萜类化合物,分别鉴定为2α,3β,19α-三羟基-28-降乌苏-12-烯;2α,3β,24-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸;山香三萜二烯酸;2α,3α-二羟基乌苏-12-烯-28-酸;3-表马斯里酸;马斯里酸;齐墩果酸。其中,化合物2α,3β,19α-三羟基-28-降乌苏-12-烯和2α,3β,24-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸为首次从香茶菜属植物中分离得到。该研究具有一定的实际意义。

无花果叶醇溶性成分的研究

新鲜无花果叶经干燥、破碎，用９５％乙醇浸提，浸提液浓缩后得到的浸膏用１０％ＫＯＨ的９５％乙醇溶液皂化、乙醚萃取，分成两组：乙醚相为非皂化组分Ａ；皂化液为皂化组分Ｂ。经ＴＬＣ和柱层析分离，从Ａ中分离出β－香树脂醇、β－谷甾醇；从Ｂ中分离出补骨脂素。用ＧＣ／ＭＳ、ＩＲ予以检测、认定。

山香圆叶化学成分的研究(三)

从山香圆(Turpinia arguta Seem.)叶的醇提物中,又分得四个结晶化合物,其中三个化合物根据光谱分析和理化常数被鉴定为α-香树脂醇、熊果酸和19α-羟基熊果酸,另一化合物结构尚待确定。

长叶香茶菜中的三萜类化合物

为研究长叶香茶菜Rabdosia stracheyi(Benth ex Hook.)Hara的化学成分,本文采用硅胶、反相硅胶C 18、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、反相半制备高效液相等色谱方法对长叶香茶菜地上部分进行分离、纯化,利用1 H NMR、13 C NMR、HR-ESI-MS等波谱数据,结合参考文献,鉴定化合物的结构。结果表明,从长叶香茶菜地上部分分离得到12个三萜类化合物,它们分别是木栓醇(1)、齐墩果酸(2)、3β-羟基-齐墩果烷-11,13(18)-二烯-28酸(3)、2α,3α-二羟基齐墩果-12-烯-28酸(4)、2 a,3a,24-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸(5)、2α,3β,24-三羟基齐墩果-12-烯-28酸(6)、cleistocalyxin(7)、熊果醇(8)、2α-羟基乌苏酸(9)、2a,3a,24-三羟基熊果-12,20(30)-二烯-28-酸甲酯(10)、maquatic acid(11)和2α,3α,24-三羟基-12,20(30)-二烯乌苏酸(12)。以上得到的三萜类化合物均为首次从该植物中分离得到。