过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。

稳定表达水通道蛋白-4细胞株的建立及应用价值

目的构建水通道蛋白-4(AQP4)真核表达载体,转染HEK293细胞建立稳定表达AQP4的HEK293细胞株,并将其应用价值与现有的酶联免疫吸附(ELISA)法进行比较,为视神经脊髓炎(NMO)的诊断提供新的方法。方法用RT-PCR法从小鼠小脑皮质中克隆AQP4基因,将其连入质粒pcDNA3.1,构建AQP4真核表达载体pcDNA3.1-AQP4;用脂质体转染法将重组质粒转染HEK293细胞,G418筛选稳定表达细胞株;RT-PCR和间接免疫荧光法(IFA)检测AQP4基因的表达情况;以稳定细胞株为底物用IFA法检测81例患者血清抗AQP4抗体,并与ELISA检测方法进行比较。结果琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出993 bp的条带;与载体连接后得到酶切正确的重组质粒;RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;IFA法检测转基因HEK293细胞,呈抗AQP4阳性。IFA法检测患者血清中AQP4抗体的敏感性为93.3%,特异性为97.4%,正确指数为90.7%,与ELISA法一致性为96.3%。结论成功克隆并构建小鼠AQP4基因真核表达载体,成功建立稳定表达AQP4的HEK293细胞株,该细胞株对NMO具有良好的检测效果,有望在NMO的临床诊断中发挥重要作用。

四种临床常用烤瓷合金对人正常肾细胞的毒性实验研究

目的:针对四种临床常用烤瓷合金进行细胞毒性检测,探讨临床常用烤瓷合金对人肾细胞(293细胞株)的毒性对比实验研究,选择适宜人体安全性能高的烤瓷合金,为临床应用提供相应的理论参考数据。方法:用含20%胎牛血清的1640培养基培养人正常肾细胞293细胞株,制备四种烤瓷合金的浸提液(根据IS010993)。用1d 3d 5d四种烤瓷合金浸提液分别干预293细胞2d 4d 6d。对细胞生长状态进行观察,记录形态变化。并分时段分别进行MTT实验检测细胞相对增值率。结果:细胞毒性影响,镍铬合金>含钛合金>银钯合金>钴铬合金。结论:根据患者础条件和需要,合理选择烤瓷合金修复体。

MicroRNA表达载体对大鼠KiSS1基因的干预效应

目的在细胞水平观察microRNA(miRNA)载体瞬时转染293T细胞株后对KiSS1基因转录、翻译的干预效应。方法以SD大鼠基因组DNA为模板,克隆KiSS1基因全长序列,构建重组载体pcDNA3.1(+)-KiSS1。应用miRNA设计软件,针对大鼠KiSS1基因的4个不同靶位点设计4对干扰序列及1对非相关性的阴性对照序列,得到miRNA表达载体p-KiSS1-miRNA1-4及p-KiSS1-miRNA-neg。利用脂质体介导将上述载体与pcDNA3.1(+)-KiSS1共转染293T细胞,采用荧光显微镜及免疫荧光技术检测转染72 h后细胞中各载体表达。采用实时荧光定量-PCR(RT-RCR)及Western blot技术观察转染48 h及72 h后miRNA表达载体对KiSS1基因的干预效应。结果荧光显微镜观察到miRNA载体转染293T细胞后可表达绿色荧光蛋白,免疫荧光结果显示转染pcDNA3.1(+)-KiSS1载体组可见红色的KiSS1蛋白在细胞质中表达;RT-PCR结果显示干预组细胞KiSS1 mRNA表达显著低于阳性对照组和阴性对照组(Pa<0.05)。其中p-KiSS1-miRNA2组KiSS1基因表达抑制最显著,降低了85%;Western blot结果显示p-KiSS1-miRNA2干预组KiSS1蛋白表达明显低于阳性对照组及阴性对照组。结论 4个miRNA载体对大鼠KiSS1基因均具有抑制效应,其中针对KiSS1 mRNA序列304～324 bp的p-KiSS1-miRNA2抑制效果最佳,为个体水平沉默KiSS1防治性早熟的研究提供依据。

新型NK1受体拮抗剂的合成及生物活性研究

目的制备一类新型N-甲基-N-(4-(2-苯甲基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-3-吡啶基)苯甲酰胺衍生物,并评价其对NK1受体的体外拮抗活性。方法以6-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-(2-甲基苯基)烟酰胺为起始原料,经过霍夫曼降解、酰胺还原和N-酰化等化学反应得到目标化合物;采用钙流实验,在HEK293/NK1R细胞株上进行体外对NK1受体拮抗活性的测定。结果制备了13个新型化合物(Ⅰ1~Ⅰ13),并经1HNMR确证结构。化合物Ⅰ12对HEK293/NK1R细胞有较好的NK1受体拮抗活性。结论化合物Ⅰ12作为一类新型NK1受体拮抗剂,具有深入研究的价值。