功能化外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠治疗的研究

目的:探究负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的293F细胞来源的外泌体(EXO)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果。方法:利用Western印迹、透射电子显微镜以及Nanosight对超速离心分离的293F细胞上清EXO进行表征;利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞摄取EXO的生物学功能;利用EXO特异性锚定肽EXP将MOG抗原肽修饰于EXO表面,流式细胞术检测EXO与MOG抗原肽的结合效率(EXO_(MOG));活体成像检测EXO_(MOG)的体内分布;利用小鼠的临床评分、体重变化以及收样时小鼠脾细胞中调节性T细胞变化和脊髓染色,评估EXO_(MOG)对EAE小鼠的治疗效果;利用组织形态学染色检测EXO_(MOG)治疗对各组小鼠不良反应。结果:超速离心可成功分离EXO,且分离的EXO具有被细胞摄取的生物学功能;EXP外泌体锚定肽介导MOG抗原肽高效负载于EXO表面,且不影响EXO的体内分布;在EAE小鼠上测试结果显示:与未治疗组和MOG组相比,EXO_(MOG)组小鼠治疗后第24天的体重显著增加(P<0.05),行为学评分显著降低(P<0.05),且治疗后小鼠脾脏中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞显著增高(P<0.05);病理染色结果表明:EXO_(MOG)组小鼠的各组织器官未见明显病理学改变。结论:EXO_(MOG)能够有效缓解小鼠EAE疾病进展且未检测到相关不良反应。

构建稳定表达病毒相关RNA的真核细胞株及其对抗肿瘤免疫促凋亡分子的影响

目的:构建稳定表达病毒相关RNA(virus-associated RNA,VA RNA)的293F-VA细胞株,并探讨其对靶向HER2阳性肿瘤的免疫促凋亡分子表达水平的影响。方法:采用PCR方法,扩增含VA RNA的功能序列,克隆入Piggy Bac转座系统质粒,将VA RNA编码序列转入293F细胞中,经过抗性筛选和流式细胞仪鉴定,得到293F-VA细胞株。将萤光素酶、红色荧光蛋白及免疫促凋亡分子编码质粒分别转入293F-VA细胞株或亲本293F细胞株,通过萤光素酶活力检测和Western Blot实验,比较两种细胞株对外源目的蛋白表达水平的影响。结果:成功构建了Piggy Bac-VA质粒。共转染Piggy Bac-VA质粒可以明显提高细胞内Fluc蛋白的表达水平(P <0. 05)。VA RNA编码序列通过Piggy Bac转座系统转入293F细胞中,获得293F-VA细胞株。与293F亲本细胞相比,293F-VA细胞株将萤火虫萤光素酶Fluc蛋白的表达水平提高363. 9%(P<0. 05);对海肾萤光素酶Rluc蛋白及红色荧光蛋白m Cherry的表达均表现出3倍左右的提高(P <0. 05)。293F-VA细胞株不仅能够提高免疫促凋亡分子e23-Fc-Fdt-t Bid在细胞内的表达水平,并且显著增加目的蛋白向细胞外分泌的水平,较293F亲本细胞提高4. 2倍(P <0. 05)。结论:建立了稳定表达VA RNA的细胞株293F-VA,该细胞株能够显著提高抗肿瘤免疫促凋亡分子的表达水平。

CD3E蛋白真核表达及全人源CD3单克隆抗体的制备

目的:高效真核表达和纯化获得CD3E蛋白,制备全人源CD3抗体。方法:构建CD3E链胞外区真核表达质粒,利用293F悬浮细胞表达系统表达并纯化获得高纯度蛋白。选取人源化抗体转基因小鼠CAMouse-HG76进行免疫,通过细胞融合的方法获得杂交瘤细胞,再利用ELISA法和流式细胞分析法筛选CD3特异性单克隆抗体。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.4-CD3E-mFc,真核细胞表达并纯化获得纯度为85%的融合蛋白。免疫小鼠后效价高达1∶102400。杂交瘤细胞筛选获得3株CD3特异性单克隆抗体。结论:本研究成功获得了CD3E融合蛋白和CD3单克隆抗体,为后续建立ELISA检测方法、全人源治疗性抗体药物及相关研究提供基础。

一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG 2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10^11 L/mol,只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2^4和1∶2^6,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。

重组人干扰素λ1在HEK-293F细胞中的表达及鉴定

目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1),并进行鉴定。方法 通过2种信号肽[T细胞受体(T cell receptor,TCR)和天然信号肽(nature signal peptide,NSP)]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件(ubiquitous chromatin opening element,UCOE)、PFR]和目的基因rhIFNλ1构建6种信号肽-载体组合的重组质粒,以HEK-293F为宿主细胞,摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1。选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ,瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析(HiTrap SP FF)、蓝胶层析(HiTrap Blue HP)和分子筛凝胶过滤层析(Sephacryl S-100 HR)3步纯化,纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析,并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列。结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。随着转染时间的延长,6种表达产物的表达量逐渐增加,转染6 d时最高,达10~20 mg/L。低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d,细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800,纯度达97.372%,且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合;反相HPLC检测分析可见2个峰,出峰时间分别为15.6和20.0 min;质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T。结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高,为该蛋白的进一步研究奠定了基础。

伪狂犬病病毒gH糖蛋白在哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性

目的 在哺乳动物细胞中表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gH糖蛋白,并检测其免疫原性。方法PCR扩增PRV-XiangA株gH基因片段,插入哺乳动物细胞表达载体pIRES-neo3中,构建重组表达质粒pIRES-gH,将其转染至HEK-293F细胞中,悬浮培养5 d。取细胞培养上清,进行Western blot鉴定后,经镍离子层析柱纯化。将纯化的gH糖蛋白作为免疫抗原与ISA 201 VG佐剂乳化后免疫8只雌性ICR小鼠,对照组8只小鼠免疫等量佐剂。初次免疫后5和8周各加强免疫1次,并分别于初次免疫后4、7、10周采血,检测小鼠血清特异性抗体及中和抗体效价;第3次采血2 d后,使用PRV-XiangA毒株(1.5×10^(4)TCID_(50))对小鼠进行滴鼻攻毒,每日观察小鼠发病及死亡情况。结果 重组表达质粒pIRES-gH经测序鉴定构建正确。gH糖蛋白成功在哺乳动物细胞中表达并进行了糖基化修饰,且反应原性良好,在100 mL培养体积下可纯化到约625μg蛋白。免疫3次后,小鼠能产生高水平的特异性抗体,且具有中和PRV的作用,其中和抗体效价最高可达1∶256。攻毒试验中对照组小鼠全部发病并死亡;而gH免疫组有一半小鼠未发病,存活率为50%。结论 在哺乳动物细胞中成功表达了PRV gH糖蛋白,并首次证实其具有免疫保护作用,为gH糖蛋白的进一步研究及应用提供了实验依据,也为PRV亚单位疫苗的研发提供了新的思路。

猪流行性腹泻病毒S1蛋白IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的S1基因序列,与pcDNA3.1载体构建重组表达质粒pcDNA-12S1,利用瞬时转染方法将pcDNA-12S1转染至293F细胞,每隔24 h取样,进行Western-blot检测,确定最佳收样时间,并采用镍离子亲和层析技术进行蛋白纯化。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,该S1蛋白的纯度高、免疫原性好。以S1蛋白作为包被抗原,建立并优化了IgG抗体间接ELISA方法。结果显示,S1蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/m L;最佳封闭剂和最佳封闭时间为5%脱脂奶粉溶液37℃作用3 h;待检血清和酶标二抗的最佳稀释度分别为1∶100和1∶20000,最佳孵育时间均为37℃30 min。采用该方法检测猪非典型瘟病毒(APPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪轮状病毒(PoRV)的阳性血清,结果均为阴性,表明该方法特异性好;该方法的批内和批间变异系数(CV)均<9%,表明该方法重复性较好;该方法与间接免疫荧光(IFA)相比较,阳性符合率为93.54%,阴性符合率为94.74%,总符合率为94%。上述结果表明,该方法可用于检测临床猪血清中的PEDV抗体,为PEDV的感染与接种疫苗后的免疫保护状态监测提供有效依据。

线性化聚乙烯亚胺介导的高效瞬时转染条件的优化

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear,PEI)介导的高效瞬时转染条件,提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率.方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)/pcDNA3.1+,通过瞬时转染的方式将质粒转入HEK293F细胞中进行表达.对转染试剂PEI与重组质粒的比例以及收获时间进行优化,通过倒置显微镜观察、SDS-PAGE和流式细胞仪检测目标蛋白的表达量,确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件.采用优化后的条件在T500摇瓶(工作体积120 ml)中进行扩大表达.结果构建的重组质粒EGFP/pcDNA3.1+序列正确,在重组质粒浓度为3.0μg/ml、DNA∶PEI为2∶1、转染后24 h添加终浓度为2 mmol/L的丙戊酸钠、转染后4 d收获条件下,目的蛋白的表达量最高.此条件也适用于放大培养体积至T500的瞬时转染.结论优化了一种快速有效的基于PEI的瞬时转染方法来高水平表达重组蛋白.

在哺乳动物细胞中表达hIGF-1

目的:构建hIGF-1真核表达载体,通过293F细胞表达hIGF-1蛋白。方法:合成已知hIGF-1碱基序列,构建pMD18T-hIGF-1基因工程载体,PCR扩增得到hIGF-1基因序列,构建真核表达载体pcDNA3.1-hIGF-1。转化大肠杆菌DH5α菌株,经菌液PCR法、双酶切法鉴定阳性克隆,并送样测序确保阳性克隆的hIGF-1碱基序列正确。通过脂质体法将基因工程载体pcDNA3.1-hIGF-1转染293F细胞,Western-blot检测hIGF-1蛋白的表达。然后再对hIGF-1的核酸序列和蛋白功能结构进行生物信息学分析。结果:琼脂糖凝胶电泳显示在250bp处出现亮色条带,PCR成功扩增出目的条带,双酶切鉴定显示在5 400bp附近获得亮色条带,说明得到pcDNA3.1-hIGF-1基因工程载体,Western-blot鉴定结果表明成功表达hIGF-1蛋白。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-hIGF-1,并表达hIGF-1蛋白。