一种BAC载体的构建及其在CYP2A6单倍型分析中的应用

目的构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸,分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体,随后使用HindⅢ单酶切中间载体并连接,利用蓝白斑筛选获得头尾串联的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。利用STI PCR的方法扩增CYP2A6基因全长,经切胶纯化后利用BstBⅠ与MluⅠ双酶切,并与同样双酶切的pBAC-BJH载体连接,转化大肠杆菌以获得包含新突变355A>T的全长Bac克隆用于单倍型测序分析。结果成功构建了增加7个多克隆酶切位点的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。该载体具有拷贝数高、可选酶切位点多等优势。利用该载体对CYP2A6的基因分型结果显示,新突变体携带22C>T、51A>G、355A>T,3个SNP单倍型为CGT。结论成功构建了方便用于大片段基因克隆的载体pBAC-BJH,该载体可用于p450基因的单倍型分析及其他大片段基因克隆分析。

扩展细胞色素P4502A6对大位阻底物的适应性

细胞色素P450酶(P450)的分子改造及其催化的生物转化是当前的两个研究热点.本研究以扩展P4502A6的底物适应性为目标,通过尝试对P4502A6酶进行N-端修饰提高表达量、筛选随机突变库以及点突变改变活性位点重要氨基酸残基等手段,在两个随机突变体中未筛选到功能突变体,但通过点突变重要氨基酸残基获得了新的突变体P4502A6(N297Q/I300A).该突变体具有比野生型和已报道的其它突变体更广泛的底物适应性,能够催化氧化大位阻底物6-苄氧基吲哚(6-OBzl-indole)生成蓝绿色物质.该物质经质谱测定为靛蓝类二聚体化合物.实验表明,其中两个氨基酸残基的变化都是关键突变,此结果与最新的P4502A6突变体晶体结构研究相符.计算机模拟显示,I300A突变导致活性口袋在铁卟啉环的垂直和水平方向都增大,使其能接纳在两个方向都有位阻的底物;而297位的天冬酰胺是一个功能保守的残基,N297Q的变化可能与氢键等弱作用有关.

CYP2C9、CYP2A6基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响

目的:研究CYP2C9、CYP2A6基因多态性对癫痫患儿丙戊酸钠血药浓度的影响。方法:收集单用丙戊酸钠治疗的癫痫患儿,应用荧光偏振免疫法测定丙戊酸钠血药浓度;分别采用直接测序法、巢式PCR法检测CYP2C9、CYP2A6的基因型;应用单因素方差分析研究基因多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响。结果:83例癫痫患儿根据CYP2C9、CYP2A6基因型分为3组:强代谢组(CYP2C9*1*1合并CYP2A6*1*1)、中代谢组(CYP2C9*1*3合并CYP2A6*1*1或CYP2C9*1*1合并CYP2A6*1*4)和弱代谢组(CYP2C9*1*3合并CYP2A6*1*4或CYP2A6*4*4),3组分布频率分别为73.5%、24.1%和2.4%。中代谢组的标准化血药浓度显著高于高代谢组(P<0.05),低代谢组的标准化血药浓度均数比其他两组高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CYP2C9、CYP2A6的基因多态性能影响丙戊酸钠血药浓度,可通过检测基因型选择合适的丙戊酸钠初始剂量。

大黄苷元对大鼠药物代谢酶CYP2A6、CYP3A4活性的影响

研究大黄苷元对大鼠体内药物代谢酶CYP2A6、CYP3A4活性的影响,以预测大黄与临床常用药物的相互作用.大鼠分组,分别灌胃不同质量浓度大黄苷元、质量分数0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、苯巴比妥钠(PB)、地塞米松(DEX)、β-奈黄酮(β-NF)和酮康唑(KET),取各给药组给药后24 h的肝微粒体(RLM)与CYP2A6、CYP3A4的探针底物香豆素、睾酮进行体外温孵,通过高效液相色谱法分别测定各底物的代谢产物7-羟基香豆素、6β-羟基睾酮的生成量,考察大黄苷元对CYP2A6、CYP3A4活性的影响.大黄苷元高、中、低剂量给药组代谢产物7-羟基香豆素的生成量高于空白给药组和KET给药组,均有统计学意义(P<0.05)、(P<0.01),大黄苷元高剂量给药组代谢产物6β-羟基睾酮的生成量高于空白给药组和KET给药组,均有统计学意义(P<0.05)、(P<0.01).随着大黄苷元给药剂量的增加,7-羟基香豆素、6β-羟基睾酮的生成量均随之增加.大黄苷元对CYP2A6、CYP3A4均有诱导作用,并且随着大黄苷元剂量的增加,其对CYP2A6、CYP3A4诱导作用均增强.

人肝细胞色素P450含量及其同工酶1A1、2A6活性的测定

从成人肝细胞中提取微粒体，测定其蛋白浓度、细胞色素Ｐ４５０（ＣＹＰ４５０）总量，并建立了通过测定代谢产物异噁唑和香豆素生成量确定ＣＹＰ４５０ 同工酶ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ａ６ 活性的测定方法。结果表明：该测定方法简单、稳定、重复性好。人肝微粒体于－ ８０°Ｃ保存６ 个月对其活性无明显影响。

CYP2A6基因多态性与肺癌易感性关系的研究

背景与目的代谢活化酶细胞色素P4502A6(CYP2A6)在尼古丁氧化及其他烟草致癌物的活化过程中发挥重要的作用。研究认为携带CYP2A6缺失型等位基因的个体患肺癌的危险性降低。本研究旨在探讨CYP2A6与肺癌易感性的关系,为确定肺癌易感性遗传标记提供依据。方法采用病例-对照研究方法及巢式PCR技术检测原发性肺癌组(180例)及对照组(224例)的CYP2A6代谢酶基因型。结果对照组只检测出1例纯合型CYP2A6缺失,CYP2A6杂合缺失型所占比例为13.4%。在肺癌组中CYP2A6杂合缺失型所占比例为12.8%,未能检测出纯合型CYP2A6缺失。两组间比较没有统计学差异(P>0.05)。结论CYP2A6突变基因在肺癌组及对照组中的频率分布没有差异。

人细胞色素P4502A6cDNA克隆及其在哺乳类细胞中的表达

应用逆转录 -聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术和DNA重组技术从人肝组织中克隆细胞色素 P4502 A6( CYP2 A6) c DNA片段至克隆载体 p Blue-script SK( M1 3- )中 ,经限制性酶切图谱分析确证克隆的片段为 CYP2 A6c DNA,然后将该片段亚克隆入真核细胞表达载体 p REP9,用改良磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠肺 CHL细胞系 ,建立 CHL- 2 A6转基因细胞系 ,并对 CYP 2 A6特征表达酶香豆素 - 7-羟化酶 ( COH)活性进行了测定 ,结果显示 CHL-2 A6S9组分的 COH比活性是 ( 2 .58± 0 .68) nmol· min-1· g-1蛋白 ,而对照细胞 CHL测不到 COH活性 ,表明所转 CYP2 A6c DNA表达的蛋白质具有功能 .CHL - 2 A6的建立为药物代谢研究和毒理学研究提供了强有力的工具 .

CYP2A6~* 4基因多态性对右美托咪定药动学的影响

目的:在CYP2A6~*4突变频率高的中国人中测定CYP2A6~*4等位基因对右美托咪定药代动力学的影响,为临床提供参考。方法:31名手术患者通过静脉泵接受0.5μg/kg右美托咪定后,抽取多个时间点的血样,测定血药浓度以及CYP2A6~*4的多态性,并进行统计分析。结果:9名患者为~*1/~*4或~*4/~*4,22名患者为~*1/~*1。主要药代动力学参数如下,曲线下面积(AUC)为(1 396.19±332.47)h·ng·L^(-1),峰值血药浓度(C_(max))为(495.50±104.90)ng/L,分布容积(V)为(0.68±0.20)L/kg,清除率(CL)为(0.38±0.11)L·h^(-1)·kg^(-1),分布半衰期(t_(1/2α))为(0.05±0.01)h,消除半衰期(t_(1/2β))为(2.53±0.04)h。在CYP2A6~*1/~*1,~*1/~*4和~*4/~*4患者中未发现显著的药代动力学差异。结论:中国患者使用右美托咪定后,t_(1/2β)与公布的一致,但t_(1/2α),V和CL较低。在制定右美托咪定的精准治疗方案时,可不予考虑CYP2A6~*4突变。

CYP2A6多态性对尼古丁代谢及烟草依赖行为的影响

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)超基因家族是人体内最重要的药物代谢酶,其中的一些亚型所具有的基因多态性表现出人体对药物和/或环境化合物毒性、敏感性存在差异,CYP2A6为其一例.

细胞色素P450酶2A6基因多态性与123例汉族吸烟人群牙周炎及炎性细胞因子表达水平的关系

目的:检测细胞色素P450酶2A6(CYP2A6)基因多态性与汉族吸烟人群牙周炎及炎性细胞因子表达水平的关系。方法:收集2018年10月—2019年10月常州市口腔医院收治的123例吸烟牙周炎患者为实验组,同期125例非吸烟牙周炎患者为对照组。收集患者一般资料,包括年龄、性别、体质量指数(BMI)、咀嚼、刷牙习惯和磨牙情况;检测菌斑指数(PLI)、牙龈出血指数(BI)、牙周探诊深度(PD)和附着丧失(AL)。采用PCR扩增CYP2A6;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测龈沟液中炎性细胞因子白介素(IL)17、IL-1、IL-6、IL-23和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。采用SPSS25.0软件包对数据进行统计学分析。结果:2组性别,PLI,龈沟液中IL-17、IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α水平存在显著差异(P<0.05)。对所有样品进行PCR扩增,未扩增出的23例判定为CYP2A6缺失型(CYP2A6del),其中,实验组5例、对照组18例;扩增出的225例判定为CYP2A6野生型(CYP2A6wt),其中,实验组118例、对照组107例。2组CYP2A6基因型存在显著差异(P<0.05)。实验组不同CYP2A6基因型IL-1水平、PLI存在显著差异(P<0.05);对照组不同CYP2A6基因型IL-17水平、PLI存在显著差异(P<0.05)。结论:CYP2A6基因型在汉族人群牙周炎患者是否吸烟中存在差异,但与炎性细胞因子水平的关系尚不明确。

检测CYP2A6基因多态性的PCR技术的基因型方法

综述检测CYP2A6基因多态性的PCR技术的基因型方法。CYP2A6基因多态性存在于白种人、东方人及非洲裔美国人群中 ,包括CYP2A6 1至CYP2A6 12 ,总共 12个变异等位基因。本文列举了检测CYP2A6基因型的不同的DNA来源、引物和限制性内切酶。已开发PCR技术结合诊断性限制性内切酶分析 (RFLP)如两步PCR和一步PCR RFLP方法检测CYP2A6基因型。此外 ,尚有PCR SSCP +RFLP及直接DNA测序方法。

以咖啡因为代谢探针测定细胞色素P450 CYP2A6活性

Aim To establish a HPLC method for determining five major metabolites of caffeine in the urine,5-acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil(AFMU),1-methylxanthine(1X),1-methyluric acid(1U),1,7-dimethyluric acid(17U) and 1,7-dimethylxanthine(17X) and assess the activity of cytochrome P-450 CYP2A6.Methods The contents of five major metabolites of caffeine in the urine were determined by RP-HPLC method.Frequency distribution histogram was drawn by calculating the 17U/(AFMU+1X+1U+17X+17U) and then evaluated the activity of CYP2A6.Results The frequency distribution histograms of CYP2A6 approximately indicated three distinct groups,the cut of point is 0.23 between fast metabolizer and intermediate type.And the cut of point is 0.15 between slow metabolizer and intermediate type.Conclusion The method is simple and rapid,suitable for the determination of metabolites of caffeine in urine.The method can be used to assay the activity of CYP2A6.

CYP2A6酶活性调节机制的研究进展

CYP2A6是一个在药理和毒理学上均占有重要地位的代谢酶,香豆素和尼古丁主要由它介导转换,并与吸烟疾病密切相关;而核不均一核糖核蛋白A1(hnRNPA1)是一个在转录后水平上发挥重要调节作用的蛋白,对于某些特异基因,转录后调节影响占有重要的地位。CYP2A6酶活性与hnRNPA1关系的研究是近几年来受到学者关注的,该文试图阐述转录后水平上hnRNPA1对CYP2A6活性的调节影响,更好地掌握CYP2A6活性变化规律,对于指导临床用药及烟瘾戒断治疗有重要的意义。

一种新的人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆

目的 :克隆人细胞色素P45 0 2A6cDNA。方法 :用逆转录 -PCR和DNA重组技术 ,从人肝组织中扩增人细胞色素P45 0 2A6基因的cDNA ,并将其连接到pBluescript载体上 ,对CYP2A6cDNA进行全序列测定。结果 :所克隆的cDNA与Yamano等发表的CYP2A6cDNA序列相比 ,在编码区有两个变异 ,即codon 8CTG→TTG ,编码的氨基酸不变 ,为亮氨酸。codon479GGC(甘氨酸 )→GTC(缬氨酸 ) ,其余均相同。而在其 3′端非编码区变异很多。与Fernandez -Salguero等报道的CYP2A7序列相比 ,其 5′端虽与所克隆的CYP2A6有较多差异 ,但其codon479也是GTC(缬氨酸 ) ,在 3′端非编码区仅略有差异。而所克隆的CYP2A6cDNA与Yamano等报道的CYP2A7序列相比 ,3′端非编码区至所设PCR引物止 ,所克隆的基因序列完全相同 ,而在编码区却差异较多。结论 :本实验室克隆的CYP2A6cDNA是一种新的CYP2A6cDNA序列 。

定点突变法确定人体CYP2A6和CYP2A13香豆素代谢的关键氨基酸

【目的】通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基,提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记的依据。【方法】运用定点突变和Sf9昆虫杆状病毒蛋白表达体系产生CYP2A6和CYP2A13在300,301以及369位点氨基酸互换的突变体蛋白质,测定系列香豆素浓度下的各个酶蛋白对香豆素7-羥化的催化反应活性,获得动力学参数并与野生型酶蛋白进行比较分析。【结果】与野生型CYP2A6相比较,其Ile300→Phe突变体催化效率(Kcat=Vmax/Km)显著下降而Gly301→Ala突变体催化效率显著上升(1.64和8.02相对于野生型3.56,P<0.01)。与之相对应,CYP2A13的Phe300→Ile突变体催化效率则明显上升而Ala301→Gly突变体催化效率显著下降(1.03和0.06相对于野生型的0.27,P<0.05)。这些酶催化特性的改变,主要是由于Vmax的改变所致。369位的氨基酸残基,无论是Ser还是Gly对CYP2A6或CYP2A13的香豆素7-羥化反应催化活性均无明显的影响。【结论】300和301位的氨基酸是影响CYP2A6及CYP2A13对香豆素7-羥化反应催化活性的关键残基,而369位氨基酸不影响此活性。

CYP2A6基因多态性与晚期肿瘤患者S-1化疗获益关系的Meta分析

目的运用系统回顾和Meta分析的方法评价CYP2A6基因多态性与S-1化疗获益的关系。方法检索Pubmed、CNKI、CBM和万方中文数据库,按照纳入和排除标准筛选关于CYP2A6基因与S-1化疗获益相关的病例对照研究或队列研究,检索时限为数据库建库至2014年6月。使用Rev Man 5.3和Stata 11.2进行统计分析。结果共纳入7篇文献进入分析,文献质量评价结果显示纳入研究质量良好。一般资料结果显示,在东方人种中,CYP2A6＊1/＊1（W/W）频率平均为25.6%;CYP2A6＊4A,＊7,＊9,＊10存在一种突变（W/V）频率平均为48.8%,CYP2A6＊4A,＊7,＊9,＊10存在2种突变（V/V）频率平均为25.6%。Meta分析发现：1突变型V/V与野生型W/W及突变型W/V患者的S-1化疗敏感性差异有统计学意义,合并优势比（OR）为0.27（95%CI：0.14~0.51）;2野生型W/W与突变型W/V及V/V生存HR差异有统计学意义,合并HR值为1.71（95%CI：0.99~2.94）。结论 CYP2A6＊4A,＊7,＊9,＊10与晚期肿瘤患者S-1化疗获益存在一定关联性。但因为纳入研究的数量有限,需要有大样本、多变量的分析研究来进一步证实和完善本研究结果。

Real-time PCR检测人非小细胞肺癌中CYP2A6基因的表达

目的检测肺癌及相应癌旁正常组织中细胞色素P450 2A6(CYP2A6)mR NA的表达,探讨其可能的临床意义。方法采用Real-time PCR技术比较人肺癌与相应癌旁正常组织中CYP2A6mRNA的表达差异,并比较CYP2A6基因的表达与患者临床病理参数的关系。结果 CYP2A6 mR NA在肺癌组织中的表达低于对应的癌旁组织(P<0.05),CYP2A6 mRNA的表达程度与患者的性别、年龄、肺癌的病理分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)。结论 CYP2A6 mRNA在肺癌组织中的表达下调,提示CYP2A6基因表达下调可能在肺癌的发生发展中起作用。

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的 :建立CYP2A6基因多态性的一步PCR RFLP分析法。方法 :取外周静脉血 10 0 μl,用Rose法提取基因组DNA ,用特异性引物CYP2A6F0 3:5’ CTGATCGACTAGGCGTGGTA 3’ ,CYP2A6R0 6 :5’ CGTCCTGGGTGTTTTCCTTC 3’进行一步PCR扩增 ,用限制性内切酶DdeⅠ ,XcmⅠ对PCR产物进行酶切 ,3%琼脂糖凝胶电泳。结果 :扩增的PCR产物大小为 2 14bp ,部分血样标本未获得PCR扩增产物 ,判为CYP2A6缺失基因型(CYP2A6del/CYP2A6del)。DdeⅠ酶切后 ,凝胶电泳可得到部分酶切 (CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型 ) ,未被酶切(CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型 )两种类型DNA片段 ;XcmⅠ酶切后 ,凝胶电泳可得到部分酶切 (CYP2A6wt/CYP2A6v1基因型 ) ,未被酶切 (CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型 )两种类型DNA片段。其中 ,部分血样标本同时被DdeⅠ和XcmⅠ部分酶切 (CYP2A6v2 /CYP2A6v1基因型 )。应用此方法检测 ,发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测 ,上述结果一致。结论 :采用一步PCR RFLP技术可以建立简单、稳定。

CYP2A6基因多态性与食管癌易感性的关系

目的:研究CYP2A6基因rs8192720多态性与新疆汉族食管癌易感性的关系。方法:采用病例-对照研究方法,以聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)技术,分析107例食管癌患者(病例组)和204例非食管癌患者(对照组)CYP2A6基因rs8192720A/G位点基因型的分布,并比较不同基因型与食管癌易感性的关系。结果:GG、GA、AA基因型在病例组中的分布频率分别为66.35%、32.69%和0.96%,在对照组中为69.59%、27.84%和2.58%,两组间基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.45,P=0.48);GG和GA+AA基因型在病例组和对照组中分布差异也无统计学意义(χ2=0.33,P=0.57)。结论:CYP2A6基因rs8192720A/G位点多态性与新疆地区汉族人食管癌易感性无相关性。