北京市同性恋HIV-1感染者的包膜基因C2-V3区序列测定和亚型分析

目的 了解北京市同性恋HIV-1感染者HIV-1的亚型类型及传播来源和流行时间。方法 应用套式聚合酶链式反应（PCR）对12份1993～2001年北京市HIV-1阳性同性恋者外周血单个核细胞（PBMC）的核酸样品进行扩增,并对其包膜区的C2-V3段的306个核酸序列进行测定和分析。结果12份样品全部是B亚型的HIV-1毒株序列,其亚型内的基因离散率为 10.35± 2.06,与国际 A-E亚型共享序列比较后发现其与 A、C、D、E亚型的共享序列的基因离散率均大于 25％,而与国际 B亚型共享序列的基因离散率仅为11.25±3.60。系统树分析显示,12个毒株与B亚型共享序列聚在一起并远离其它国际亚型,并且12个毒株与SF162紧密相连,而与国际B亚型共享序列和泰国B亚型代表株TH14可以分开。对gp120中最重要的中和抗体决定簇V3环序列进行对比分析发现,12毒株在V3环中变化较大,其中4毒株带有GPGR这一欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征,占33.33％,1个毒株带有GLGR,占8.33％,而其它7个毒株为GWGR,占58.34％。结论HIV-1在北京市同性恋人群中流行的为B亚型,流行来源为欧美,流行时间10年左右,V3环顶端四肽序列特征以GWGR为主。

山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定

1目的 了解山东省 1型人类免疫缺陷病毒 (HIV- 1)的分子流行病学特征。 2方法 应用套式聚合酶链反应扩增 8例 HIV- 1前病毒基因组的 env基因 C2 - V 3区 ,扩增产物纯化后与 p GEM- T载体连接 ,克隆于大肠杆菌中 ,提取阳性克隆的重组质粒进行测序 ,用 PHYL IP软件分析核苷酸及氨基酸序列。 3结果 8株 HIV - 1毒株V3环顶端的四肽基序均为 GPGR,氨基酸变异不显著 ,各株间基因离散率为 1.0 %～ 5 .2 % ,侧翼区碱基的变异频率明显高于 V3区 ,并发现 1例毒株出现双 V 3环现象。 4结论 山东省的 HIV - 1分离株以 B亚型 HIV- 1毒株为主 ,同时发现的双 V3环变异现象 ,可能是 HIV - 1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式。

丙型肝炎病毒河北株E2蛋白胞外核心区的真核表达及应用

目的真核细胞表达丙型肝炎病毒(HCV)河北株E2蛋白胞外核心区(E2c)并利用E2c蛋白检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平。方法以HCV1b型(河北株)基因序列为基础,设计HCV1b E2c基因序列并通过基因拼接的方法合成;将含有组织型纤溶酶原激活物(t PA)信号肽的E2c扩增产物克隆入p CI-neo真核表达载体,获得p CI-tpa-1b E2c载体;将p CI-tpa-1b E2c真核表达载体转染HEK293T细胞,收集细胞上清后进行浓缩及纯化,Western blot法鉴定蛋白特异性;以获得E2c蛋白为抗原,建立基于雪花莲凝集素(GNA)的改良ELISA检测HCV患者血清特异性抗E2c抗体水平。结果成功利用真核表达系统表达获得E2c蛋白,建立了GNA改良ELISA检测HCV患者血清中抗E2蛋白抗体的方法。结论成功在HEK293T细胞表达HCV-1b E2c蛋白并进行了临床应用。

胰岛素对子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路活化的影响

背景与目的探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞Src同源区2结构域蛋白C（Shc）活化、Shc与生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的结合水平及对细胞外信号调节激酶（ERK）活化程度的影响。方法10-6mol/L胰岛素作用子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞不同时间,检测不同时间点细胞Shc磷酸化、Shc·Grb2复合物水平以及ERK的磷酸化程度。结果胰岛素以时间依赖方式活化导子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路,Shc在胰岛素作用1min即出现活化增强,15min时达到峰值[p-p52Shc/p52Shc（73.75±2.93vs16.89±1.92）;p-p46Shc/p46Shc（35.65±5.17vs13.71±2.77）]。细胞静息状态下检测不到Shc·Grb2复合物,胰岛素能促进Shc·Grb2结合,与Shc活化时程一致,即1min可检测出Shc·Grb2结合,15min时结合程度最大。胰岛素显著诱导子宫内膜癌细胞ERK活化,具有时间依赖性,作用30min时达到峰值（p-ERK/ERK：63.40±4.52vs22.66±3.76）。结论胰岛素以时间依赖模式促进子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞Shc活化、Shc·Grb2结合以及ERK的活化。

SHCBP1在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的研究SHCBP1基因在人肝癌组织中的表达情况,探讨SHCBP1基因在肝细胞癌发生发展中的作用。方法采用半定量RT-PCR、荧光定量PCR(时实PCR)、免疫组织化学法等方法检测SHCBP1基因在52例临床肝细胞癌样本的癌及癌旁组织和人正常组织的表达情况,应用统计学方法分析结果。结果①SHCBP1基因mRNA表达水平在人正常组织中表达具有明显差异;在肝细胞癌样本中明显高于癌旁组织(P<0.05);②免疫组化结果检测显示SHCBP1蛋白在癌旁组织组织中低表达或不表达,而在肝细胞癌组织中表达明显增高,且棕色染色区域主要集中在肿瘤细胞边缘细胞膜位置;③Western blot检测结果显示SHCBP1蛋白在肝细胞癌样本中高表达,癌旁组织中不表达或低表达(P<0.05);④临床统计资料分析显示SHCBP1基因的表达情况与肝细胞癌患者的性别、年龄、临床分期无关,而与肿瘤的直径大小、个数、分化程度、脉管浸润紧密相关。结论 SHCBP1基因在肝细胞癌组织中呈高表达,可能通过影响多种癌症信号通路分子促进肝癌的发生发展,同时该基因可能成为肝癌治疗的潜在新靶点。

抗人凝血因子Ⅷ-C1C2区单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人凝血因子Ⅷ(FⅧ)C1C2区单克隆抗体(mAb),并对其进行生化和生物学鉴定。方法采用基因重组技术表达FⅧ-C1C2区蛋白(rFⅧ-C1C2),以rFⅧ-C1C2免疫8周龄Balb/C小鼠,小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,ELISA法筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗rFⅧ-C1C2mAb的细胞株,并对mAb进行生化和免疫学鉴定。结果获得一株抗rFⅧ-C1C2区单克隆抗体阳性克隆2B11,命名为SZ-133。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类,Westernblot法证实SZ-133可与rFⅧ-C1C2区蛋白及重组的全长FⅧ特异性结合,但不影响FⅧ的凝血活性。结论表达了rFⅧ-C1C2,并制备出了抗人凝血因子Ⅷ的单克隆抗体SZ-133,它能特异识别血浆及重组的FⅧ,有可能用于基础和临床应用研究。

HIV-1感染者中枢神经系统的病毒学特征研究

目的探讨HIV-1感染者中枢神经系统(CNS)的病毒学特征。方法通过克隆测序分析病毒亚型,观察CNS中HIV-1变异性和离散率;依据V3环11/25法则并结合10例有偿献血HIV-1感染者尸检脑组织标本免疫荧光试验分析中枢神经HIV-1复合受体的使用。结果有偿献血人群感染的HIV-1显示B和B′亚型特征,脑脊液(CSF)和外周血序列有嵌合现象;CSF C2-V5区序列变异性明显低于外周血,两者的离散率差异无统计学意义;依据11/25法则分析V3环序列可见中枢神经HIV-1大多数使用CCR5复合受体。结论 CNS HIV-1病毒变异性明显小于外周血;CNS HIV-1具有CCR5嗜性。

柯萨奇病毒A10型对利巴韦林耐药性的初步研究

近年来,全国范围内手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)的感染率逐渐上升,其中柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)是主要病原体之一,利巴韦林是临床上治疗儿童手足口病的常用药物之一。为了评价利巴韦林在体外对CVA10的抑制效果,本研究中,我们随机选取了19条2009-2021年的不同地区和不同年代的有代表性的中国内地优势流行基因型C基因型的CVA10毒株,通过细胞毒性实验(Cell counting kit-8,CCK8)来检测利巴韦林在RD细胞上对CVA10的抑制率。将抑制率大于85%的CVA10定义为对利巴韦林敏感组,抑制率小于15%的CVA10定义为对利巴韦林耐药组。结果显示利巴韦林在0.78mmol/L浓度下可以对CVA10产生较好的抑制作用并且对细胞的毒性较低。19株CVA10中有4株表现出对利巴韦林耐药性,2株表现出对利巴韦林敏感性,剩余13株的敏感性在85%~15%之间。通过7日龄ICR乳鼠感染实验比较对利巴韦林敏感组和耐药组毒株的致病力差异,通过观察乳鼠临床评分、生存率、体重及组织取材的滴度测定结果均表明对利巴韦林敏感组CVA10在小鼠上的致病力比耐药组强。进一步使用MEGA 7.0软件对影响CVA10复制和翻译的2C区氨基酸序列进行差异性分析,以分析可能的耐药位点。结果显示对利巴韦林耐药组和敏感组CVA10的2C区的327位和328位氨基酸位点存在差异。本研究发现当前国内流行的CVA10存在广泛对利巴韦林耐药现象,其中部分CVA10对利巴韦林完全耐药。因此,有必要加强对CVA10耐药株的监测,以便更好地指导临床医生正确地选择抗病毒药物,为个体化的治疗提供理论依据。

HIV1膜蛋白PND编码基因自然变异株的发现

目的 对 1例来自华东地区HIV1分离株 (WWBH7)的前病毒env基因C2 V3区进行序列分析。方法 以HIV1感染者外周血单个核细胞基因组为模板进行套式PCR扩增HIV1env基因C2 V3区片段 ,将此扩增产物插入T Vector,酶切鉴定重组质粒 ,使用ABI737自动DNA序列测定仪测定序列并用DNASIS软件进行分析。结果 DNA序列资料显示该毒株属于HIV1B亚型衍生株。但与HIV1B亚型的标准株如SF2株相比 ,该HIV1毒株的env基因V3区下游有 192bp的重复插入突变 ,使得该毒株的膜蛋白PND编码基因呈现双V3区的变异 ,该段DNA序列已登录于GenBank(AF2 2 0 2 45 )。结论 该分离株是