多中心切割2D-HPLC-QTOF法对表柔比星脂质体制剂中未知杂质的分离与结构推断

目的建立多中心切割(MHC)二维高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(2D-HPLC-QTOF)法分离和推断表柔比星脂质体制剂中未知杂质的方法。方法一维液相色谱采用Symmetry-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,以乙腈和甲醇(6:1)为流动相A,以加入十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲液为流动相B,流动相A与流动相B体积比为57:43进行等度洗脱;二维高效液相色谱采用Agilent Eclipse-C18(50 mm×2.1 mm,1.8μm)为色谱柱,以0.1%的甲酸水和乙腈为流动相,采用梯度洗脱。将一维液相色谱条件下分离的杂质峰进行多中心切割储存在定量环中,并转移至二维进行分离,以四极杆飞行时间质谱(QTOF)进行结构推断。结果该方法可以使表柔比星与杂质峰较好地分离,并且可以得到高质量杂质峰进行结构推断。在表柔比星脂质体制剂中对6个未知杂质进行有效的推断。结论建立的多中心切割二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法可高效准确的分离并推断表柔比星脂质体制剂中的未知杂质,特别是微量和难以分离的杂质,对表柔比星制剂的质量控制提供了新方法。

2D-HPLC测定枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及辛弗林的含量

目的建立二维高效液相色谱（2D-HPLC）法同时测定枳实中橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林含量的方法。方法采用2D-HPLC法,分离体系1色谱条件：ODS柱（自制预柱）（4.6×30mm,5μm）、Thermo Hypersil-Keystone C1 8柱（4.6×250mm,5μm）;流动相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B）=82：18;流速：1.0m L/min;柱温：25℃,检测波长：283nm。分离体系2色谱条件：Waters SCX柱（4.6×250mm,5μm）,流动相：60mmol/L磷酸二氢钾-乙腈=90：10;流速：1.0m L/min;检测波长：275nm;柱温：25℃。切换时间：1.0min。结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林分别在进样量0.371～2.968、0.1505～1.204、0.575～4.60、0.191～1.528μg范围内与色谱峰面积线性关系良好,加样回收率（n=6）分别为99.75%、100.81%、99.83%、100.27%,RSD分别为2.53%、1.56%、2.75%、1.43%,具较好的精密度、重复性和稳定性。结论 2D-HPLC法可用于枳实多成分的质量控制。

2D-HPLC-QTOF法对比阿培南开环物鉴定

目的建立在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-HPLC-QTOF)法鉴定比阿培南开环物的质谱方法。方法采用在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,一维液相进行分离,二维液相进行脱盐后直接进行质谱分析,根据推测结构进行化学合成该杂质,然后进行核磁结构确认。结果该方法有效地解决了比阿培南流动相中含不挥发性盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定杂质的难题并确认该未知杂质为比阿培南开环物。结论该方法可以快速、简便、灵敏、准确地用质谱来定性测定比阿培南中的开环物。

2D-HPLC-QTOF法对注射用盐酸表柔比星中二聚体的鉴定

目的建立在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-HPLC-QTOF)法检测注射用盐酸表柔比星中二聚体的质谱方法。方法采用在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,一维液相进行分离,二维液相进行脱盐后直接进行质谱分析。结果该方法有效地解决了盐酸表柔比星二聚体难制备及流动相中含不挥发性磷酸和十二烷基硫酸钠离子对试剂的色谱系统不适合用于液相色谱-质谱快速鉴定杂质的难题,并确认该未知杂质为盐酸表柔比星二聚体。结论该方法可以快速、简便、灵敏、准确地用质谱来定性测定注射用盐酸表柔比星中二聚体。

建立2D-HPLC同时检测钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的方法

目的建立二维高效液相色谱法(2D-HPLC)同时检测钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱四种钩藤生物碱含量的方法。方法采用Aston SC2(3.5 mm×25 mm,5μm)一维色谱柱,Aston SH C_(18)(3.5 mm×10 mm,5μm)中间色谱柱,Aston SCB(4.6 mm×125 mm,5μm)分析色谱柱,一维流动相为CAA-1,分析流动相为BPI-1∶MPI-1∶OPI=45∶14∶41,流速1.0 mL/min,柱温40℃,检测波长254 nm,进样量500μL,分析时间9.5 min。结果钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱线性范围分别为9.77~10000.00 ng/mL(r=0.9996)、10.74~11000.00 ng/mL(r=0.9997)、10.74~11000.00 ng/mL(r=0.9997)、10.74~11000.00 ng/mL(r=0.9996),精密度、稳定性和重复性相对标准偏差(RSD)<5.00%,准确度为95.20%~104.01%,方法回收率为93.63%~101.38%。结论建立的2D-HPLC同时检测钩藤中四种生物碱含量的方法简单准确,可作为钩藤药材质量控制的新方法。

2D-HPLC-LVI测定人血浆中的利福平

目的:建立二维高效液相色谱结合大体积进样(2D-HPLC-LVI)方法测定利福平血浆浓度,为利福平的治疗药物监测提供分析手段。方法:2D-HPLC-LVI包括萃取系统和分析系统。萃取柱为Venusil-SCX(100 mm×4.6 mm,5μm),分析柱为Xtimate-C18(250 mm×4.6 mm 5μm);两系统通过六通阀连接,采用'中心切割'模式及陷阱柱转移目标物;检测波长为333 nm,样品经蛋白沉淀,进样量为100μL,采用外标法计算结果。结果:利福平在0.20~20.00μg/mL呈良好线性关系(r=0.9997),最低定量限0.12μg/mL,绝对回收率102.7%~104.6%,日内、日间精密度RSD均<7.2%。结论:2D-HPLC-LVI测定人血浆中利福平的方法抗干扰能力强、准确度高、自动化程度高,适用于临床治疗药物监测。

基于2D-HPLC结合捕集柱技术测定人血中双氯芬酸钠浓度及其应用

目的建立二维高效液相色谱法(2D-HPLC)结合捕集柱技术测定健康受试者血中双氯芬酸钠的浓度,并将其应用到药代动力学和生物等效性研究。方法采用随机交叉试验设计,18例健康男性志愿者分别高脂饮食后口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂或参比制剂,2D-HPLC测定血浆中双氯芬酸钠的血药浓度,计算药动学参数及相对生物利用度。结果 18名受试者单次口服100 mg双氯芬酸钠缓释片受试制剂或参比制剂后的主要药动学参数AUC0→16、AUC0→∞、tmax、ρmax分别为(2 591.6±705.8)和(2 588.8±772.0)ng·h·m L^(-1)、(2 896.4±839.7)和(2 700.3±806.1)ng·h·m L^(-1)、(4.6±0.7)和(4.4±0.9)h、(1 332.8±912.5)和(1 325.7±706.3)ng·m L^(-1)。受试制剂对参比制剂的相对生物利用度为(102.4±15.1)%。结论2D-HPLC结合捕集柱技术测定人血浆中双氯芬酸钠浓度简单、快速、专属性高,高脂饮食后单次口服双氯芬酸钠缓释片受试制剂和参比制剂生物等效。

2D-HPLC同时测定小鼠胸腺中的酸性氨基酸异构体

目的研究D-酸性氨基酸的代谢组学，建立同时分离和定量体内样品中酸性氨基酸D、L体的离线二维HPLC法。方法利用硅胶基质ODS整体柱为第-维分离色谱柱，流动相为乙腈-三氟醋酸-水（9：0．05：91）；Chiralpak QD-1-AX色谱柱为第二维手性分离柱，流动相为含10mmol·L^-1柠檬酸的甲醇-乙腈（50：50），荧光法检测，离线手性2D—HPLC分析系统。结果两对对映体能同时得到良好地分离（R，〉2．50）；各异构体的定量线性范围均为0．005—5pmol（r〉0．9998），检出限和定量限分别为2、5fmol，回收率均在98％-105％，日内日间精密度的RSD均〈5％。应用该法测得SAMP1及SAMR1小鼠胸腺组织中D-天门冬氨酸的浓度分别为212．2、163．4nnmol·g^-1（n=6）。结论所用方法具有较高的选择性、灵敏度和准确性，可用于体内样品中酸性氨基酸异构体的同时测定。

基于离线2D-HPLC-DPPH-ESI-Q-TOF/MS联用技术的金银花抗氧化成分系统筛选研究

目的建立基于离线二维色谱-二苯基三硝基苯肼-电喷雾飞行时间质谱结合技术(2D-HPLC-DPPH-ESI-Q-TOF/MS)的金银花中抗氧化成分系统筛选方法。方法采用离线二维色谱对金银花提取物进行分段富集、分析,第一维采用semi-PREP-HPLC技术对金银花提取物进行极性分段制备和富集浓缩,第二维分别采用亲水和反相色谱技术进行分析;进一步结合DPPH在线筛选技术实现金银花复杂组分中抗氧化成分的快速发现;采用ESI-Q-TOF/MS技术进行初步鉴别,并通过部分单体化合物的体外抗氧化活性评价对筛选结果进行验证。结果该方法可以实现金银花中不同极性和不同含量抗氧化成分的快速筛选,从金银花提取物中共筛选出36种具有抗氧化活性的成分,采用高分辨质谱初步鉴定出12种,对9种成分进行活性验证,其中7种成分(异绿原酸B、异绿原酸A、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C、芦丁、隐绿原酸、绿原酸)的半数抑制浓度(IC50)优于阳性对照维生素C。结论该方法高效、快速,为复杂体系天然产物中不同极性和含量抗氧化成分的发现提供了技术和平台支持。

阿莫西林胶囊热降解聚合物杂质的2D-HPLC分析及质谱裂解机理探讨

目的:建立阿莫西林胶囊中热降解聚合物杂质的分析方法。方法:采用高效凝胶排阻色谱法(HPSEC法),使用Shimpack Bio Diol-60(4.6 mm×300 mm,3μm)二醇基高纯硅胶色谱柱,进样量为20μL并以254 nm为检测波长,进行阿莫西林和聚合物杂质的分离。通过优化HPSEC中流动相pH、缓冲盐浓度、有机相比例等色谱条件,结合阿莫西林13个杂质对照品,考察不同杂质的出峰规律。采用高效二维液相色谱法(2D-HPLC法),使用500μL样品环将HPSEC分离所得聚合物杂质通过中心切割转移到二维反相色谱中脱盐,二维采用质谱兼容流动相,高分辨质谱分析确认结构。结果:HPSEC法中流动相pH是影响阿莫西林与聚合物峰分离的关键因素。杂质对照品在HPSEC的保留时间研究表明色谱分离未严格按照相对分子质量大小的顺序进行。通过对聚合物杂质K和J的质谱裂解行为研究揭示了β-内酰胺类抗生素的一般裂解规律。2D-HPLC法对阿莫西林热降解溶液深入分析,主峰前聚合物峰在二维进一步分离出14个化合物,为阿莫西林二聚体、三聚体、四聚体及其异构体。结论:HPSEC与RP-HPLC结合组成的二维色谱高分辨质谱系统可作为更精准的聚合物发现的手段。

不同方法加工生地黄的2D-IR和HPLC检测结果相关性比较

目的:建立简单、有效的评价不同方法加工的生地黄的质量的方法。方法:利用二维相关红外光谱技术(Twodimensionalinfraredcorrelationspectroscopy,2DIR)结合HPLC分别从宏观和微观角度对多种不同方法产地加工的生地黄进行质量评价。结果:表明二者具有良好相关统一性。结论:可以利用2DIR结合HPLC分别对不同方法产地加工的生地黄进行质量评价。

应用IP-2D nano-HPLC-MALDI-TOF-TOF鉴定蛋白质泛素化修饰

近年来,在蛋白质研究中,特别是在蛋白质翻译后修饰(PTM)的研究中,生物质谱技术的应用越来越广泛,与纳升级HPLC的联合应用,使这一技术手段更加有效.针对泛素化在细胞功能调控中发挥关键作用的PTM的特点,将免疫沉淀、2Dnano-HPLC和基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(IP-2D nano-HPLC-MALDI-TOF-TOF)有机整合,建立了天然状态下蛋白质泛素化位点的鉴定方法,并应用这一方法确定出K562细胞内具有酪氨酸激酶活性的蛋白c-ABL的泛素化位点.为定性鉴定生理和病理状态下内源性蛋白的泛素化修饰提供了借鉴.

头孢克洛聚合物杂质的分析

目的对头孢克洛中聚合物杂质的结构进行初步鉴定,对其产生机理进行初步分析。方法以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)为溶剂,室温放置4 d,制备头孢克洛强制聚合溶液;采用HPSEC法对强制聚合物溶液中各杂质进行分离,结合二维液相脱盐技术、柱切换-LC/MS^(n)技术,根据各杂质一级、二级精确质量信息及聚合机制,初步鉴定主峰前各杂质结构。结果对头孢克洛强制聚合溶液中的9个聚合物杂质结构进行初步解析,并初步分析其产生机理。结论强制聚合溶液可作为头孢克洛原料及制剂中聚合物杂质研究分析用系统适用性溶液。本研究中推测的聚合物杂质结构对头孢克洛原料及其制剂的杂质谱研究及质量控制有重要参考意义。

富马酸丙酚替诺福韦片中有关物质测定及杂质鉴定

目的建立检测富马酸丙酚替诺福韦片中有关物质含量的高效液相色谱法,以及鉴定制剂中未知湿热降解杂质化学结构的二维液相色谱-三重四极杆串联质谱法。方法有关物质测定中,色谱柱为Waters XTerra MS C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为0.02 mol/L磷酸盐(1 mol/L氢氧化钾溶液调pH至6.0)-甲醇(95∶5,V/V)-甲醇(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,检测波长为260 nm,柱温为35℃,进样量为20μL。化学结构鉴定中,色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C_(18)柱(50 mm×3.0 mm,1.8μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇(55∶45,V/V),流速为0.4 mL/min,柱温为35℃,采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式,质荷比(m/z)扫描范围为100~1000,雾化气体(氮气,N_(2))压力为45 psi,干燥气(N2)流速为6 L/min,温度为350℃,碎裂电压为150 V,二级质谱碰撞裂解能量为30 eV。根据保留时间、分子量及二级碎片识别湿热降解杂质。结果丙酚替诺福韦与5个降解杂质A-E的定量限分别为0.4,0.4,2.0,2.0,0.8,0.8 ng。5个降解杂质A-E的杂质校正因子分别为0.61,0.70,3.16,0.75,0.85;平均加样回收率分别为100.20%,95.23%,102.36%,94.48%,97.26%,RSD分别为0.50%,0.23%,0.89%,1.02%,1.67%(n=9)。未知湿热降解杂质分别为杂质D乳糖加合物及丙酚替诺福韦乳糖加合物。结论该方法专属性强、灵敏度好、准确度高,可用于富马酸丙酚替诺福韦片中有关物质的含量测定,通过特征碎片离子可快速识别丙酚替诺福韦乳糖加合物类杂质。

在线二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析两性霉素B的杂质谱

建立了基于在线二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D HPLC-Q TOF/MS)的两性霉素B杂质谱分析方法。第一维液相色谱(^(1)D-LC)以XBridge Shield C18为色谱柱、甲醇-乙腈-4.2 g/L柠檬酸水溶液为流动相。第二维液相色谱(^(2)D-LC)以Xtimate C8为捕集柱,以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈(95∶5, v/v)为流动相进行捕集和脱盐;以Xtimate C8为色谱柱,以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈为流动相进行洗脱。该方法结合了在线稀释和多针捕集装置,实现了10个组分/杂质的高效分离,并通过四极杆飞行时间质谱实现了对不稳定组分/杂质的结构推断,解决了2D HPLC溶剂兼容性的难题,增加了分析通量,提高了2D HPLC的自动化能力,避免了两性霉素B与部分杂质在色谱分离过程中相互转化的问题,提高了检测灵敏度。利用该方法可以灵敏地对两性霉素B的杂质谱进行分析,所得到的研究结果对两性霉素B的生产工艺改进具有指导意义。

用2D Micro-HPLC/MS分析六种蛋白质混合物的胰蛋白酶解多肽产物

采用2D Micro-HPLC系统,用MS对六种蛋白质的胰蛋白酶解多肽产物进行了分析,实现了蛋白质的高灵敏度、高分离度的检测。结合离子交换色谱法和反相毛细管色谱法,利用六个捕集柱和脱盐系统,可对各种分离条件进行优化。因此,可以实现对多种痕量酶解多肽的分离检测。该系统是痕量蛋白质和未知蛋白质检测的有力工具,结合高性能质谱仪,可以达到非常高的灵敏度。

反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物类杂质

目的建立反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物杂质。方法以CAPCELL PAK C_(18)MGⅡ为色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),0.25%四甲基氢氧化铵溶液(p H 5.5)[每1000mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.4 mL]-甲醇-乙腈为流动相系统,梯度洗脱,建立了头孢地尼聚合物类杂质的分析方法并进行了方法学验证。采用二维液质联用法对检出的聚合物类杂质进行定性分析。结果在该色谱条件下头孢地尼及已知杂质均与头孢地尼聚合物间分离良好,头孢地尼检测浓度的线性范围为0.30~30.1μg/mL(r=1.0000),方法的检测限与定量限分别为1.5 ng和4.5 ng。所建立的方法能够检出头孢地尼二聚体,头孢地尼二聚体的多个同分异构体及头孢地尼三聚体。结论本方法专属性好,灵敏度高,耐用性好,可用于头孢地尼及其制剂中聚合物杂质的控制。

头孢拉定原料及制剂的聚合物杂质分析

目的建立头孢拉定原料及制剂中聚合物杂质的分析方法。方法采用碱降解法制备头孢拉定强制降解溶液;采用高效凝胶色谱法(TSK G2000 SWxl)和柱切换-LC/MS法对头孢拉定强制降解溶液中的聚合物杂质进行分离和结构鉴定;采用Agilent ZORBAX SB-C_(18)型色谱柱,以磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相,进行梯度洗脱,建立头孢拉定聚合物的RP-HPLC分析方法,采用二维液相色谱法和柱切换-LC/MSn法对该方法的专属性进行分析;进行方法学验证。结果在头孢拉定强制降解物中鉴定出头孢拉定二聚体、三聚体、四聚体;高效凝胶色谱法分离头孢拉定聚合物杂质时,易受到小分子杂质的干扰,同时分离的聚合物杂质色谱峰拖尾严重,存在肩峰,定量准确性差;RP-HPLC法分析头孢拉定聚合物杂质时,在20～22min范围内检出头孢拉定二聚体、三聚体、四聚体;方法定量限为500μg,最低检测限为150μg。结论高效凝胶色谱法不能对头孢拉定中的聚合物杂质进行有效质控,建立的反相色谱法分析头孢拉定聚合物杂质时专属性良好、灵敏度高、方法耐用性好,可用于头孢拉定原料及制剂的聚合物杂质质控;头孢拉定强制降解溶液可作为头孢拉定聚合物分析的系统适用性溶液。

头孢地尼原料及制剂的聚合物杂质分析

目的建立头孢地尼原料及制剂聚合物杂质的分析方法。方法分别采用0.1mol/L磷酸盐溶液和氯仿-三乙胺为溶剂,制备头孢地尼降解溶液;采用高效凝胶色谱法(HPSEC,TSK G2000 SWxl)和柱切换-LC/MSn法对头孢地尼降解溶液的弱保留值杂质进行分离和结构鉴定,并评估高效凝胶色谱法分析聚合物杂质的专属性;采用Diamonsil,C18型色谱柱,以0.25%四甲基氢氧化铵溶液(pH5.5)-甲醇-乙腈为流动相进行梯度洗脱,建立头孢地尼聚合物的RP-HPLC分析方法,采用二维色谱法和柱切换-LC/MSn法对其专属性进行分析,并进行方法学验证。结果在头孢地尼降解物中鉴定出头孢地尼二聚体及其异构体,以及若干小分子杂质;高效凝胶色谱法分离头孢地尼聚合物杂质时,小分子杂质与聚合物杂质共出峰,方法专属性与定量准确性差;RP-HPLC法分析头孢地尼聚合物杂质时,能够检出头孢地尼二聚体及其异构体,头孢地尼三聚体,专属性好。结论高效凝胶色谱法不能对头孢地尼的聚合物杂质进行有效质控,建立的反相色谱法分析头孢地尼聚合物杂质的专属性良好,可将头孢地尼降解溶液可作为聚合物杂质系统适用性溶液。

头孢噻肟钠原料的聚合物杂质分析

目的建立头孢噻肟钠原料中聚合物杂质的分析方法。方法采用浓溶液降解法制备头孢噻肟钠降解溶液;采用高效凝胶色谱法(TSK G2000 SWxl)和柱切换-LC/MSn法对头孢噻肟钠降解溶液中的聚合物杂质进行分离和结构推定;采用Agilent ZORBAX SB-C18型色谱柱,以0.05mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相,进行梯度洗脱,建立头孢噻肟钠聚合物的RP-HPLC分析方法,采用二维液相色谱法和柱切换-LC/MSn法对该方法的专属性进行分析;进行方法学验证。结果在头孢噻肟钠降解物中推定出头孢噻肟二聚体及其异构体、三聚体、四聚体;高效凝胶色谱法分离头孢噻肟钠聚合物杂质时,部分聚合物杂质在与主峰共出峰和在主峰后出峰,定量准确性差;RP-HPLC法分析头孢噻肟钠聚合物杂质时,在30~50min范围内检出6个聚合物杂质峰;主要二聚体杂质的定量限为6.3×10-5μg,最低检测限为2.0×10-5μg。结论高效凝胶色谱法不能对头孢噻肟钠原料中聚合物杂质进行有效质控,反相色谱法分析头孢噻肟钠聚合物杂质时专属性良好、灵敏度高、方法耐用性好,可用于头孢噻肟钠原料的聚合物杂质质控;头孢噻肟钠降解溶液可作为分析头孢噻肟钠聚合物的系统适用性溶液。