2DE-MS中膜蛋白质组的研究进展

2-维凝胶电泳(2DE)具有高分辨率、高通量等特点,已被广泛地用于蛋白质组的研究.然而,2DE-MS在膜蛋白质组学研究方面却有其局限性,主要因为:膜蛋白具有低丰度、难溶、等电点时易沉淀、难酶解等特点.然而随着亚细胞分离技术和直接的生化方法富集等技术的发展,低丰度问题得到了极大的改善;增溶剂(尿素,硫脲),新的两性离子和非离子去垢剂,以及有机溶剂等的利用极大地改善了膜蛋白质组的溶解性能;同时,一些新的2DE技术的利用扩大了常规2DE的分离范围.在膜蛋白裂解方面,将酶解法与化学法(CNBr)相结合,另外先进的质谱技术的发展使得膜蛋白质组的研究在最近几年取得了较大的发展.现对2DE-MS途径中,膜的富集、膜蛋白的提取、分离、酶解、鉴定方面的进展进行综述.

CA 125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义

目的研究CA125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义。方法取CA125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤和卵巢良性肿瘤、盆腔良性病变和正常妇女血清,采用双向电泳技术分离和鉴定生理状态与病理状态的差异表达蛋白,对有差异性表达的蛋白质运用MALDI-TOF-TOF串联质谱分析。结果重复性好的双向电泳图谱在CA125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清蛋白质表达谱发生了改变。将其中有差异蛋白点经指纹图谱(PMF)分析,并结合双向电泳相应点的表观等电点、分子质量、匹配片段的多少以及相关文献进行综合分析。得到CA125阴性时的蛋白质有8种,分别为结合珠蛋白α1、prostasin、cal-granulin A和calgranulin B、溶血磷脂酸(LPA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、HSP60和90。结论双向电泳-质谱法对卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清蛋白获得的结果重复性较好。CA125阴性卵巢癌患者血清结合珠蛋白α1、prostasin、calgranulin A和calgranulin B、LPA、PCNA、HSP60和90能为其提供早期诊断指标。

急性放射损伤小鼠血清蛋白质组分析

为寻找急性放射病早期诊断指标和新的治疗靶点,探讨辐射损伤的发病机理,采用蛋白质组学的双向电泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了 8Gy γ 射线照射后 24h 小鼠血清蛋白质的变化,鉴定有差异的蛋白质,并用蛋白质印迹(Western blotting)方法进行验证。结果显示,双向电泳发现 8Gy 照射后 24h 小鼠血清有一显著变化蛋白点,分子量约为 15ku,经氨基酸序列分析发现为结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)的 α 亚单位。Western blotting 方法进一步验证了双向电泳的结果。结果表明,经 8Gy γ 射线照射后 24h 小鼠血清中结合珠蛋白发生显著增加,可能在辐射损伤中发挥着一定的作用,此结果为探索急性放射损伤的发病机理提供了新的线索。

蛋白质组学在乳及乳制品特性研究中的应用

蛋白质组学工具可用于考察蛋白质的多样性。随着越来越多的细菌基因组网络资源的日益丰富,可以利用蛋白质组学技术来筛选各种发酵食品中的微生物所表达的蛋白质,提供全面而动态的研究。综述了蛋白质组学技术的发展,及其在乳蛋白质以及乳酸菌蛋白质表达研究中的应用。以奶酪为例,介绍了蛋白质组学在复杂食品基质中的应用。

近致死量照射CNE1后存活克隆生物学性状初步分析

目的放疗后残存癌细胞重新克隆是鼻咽癌放疗复发的主要原因,本实验旨在分析照射残存癌细胞的生物学特征。方法MTT法测定6MV-X射线照射人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1的近致死剂量,用近致死量照射获得残存癌细胞存活克隆,然后用流式细胞仪检测存活克隆与亲本细胞株的细胞周期分布,应用二维电泳和质谱技术分析两者的蛋白质表达改变。结果用15Gy近致死量照射CNE1得到了照射存活克隆,并命名为CNE1-15GyR。CNE1-15GyR与亲本细胞株相比:G1/G0期比例增高而G2/M期比例降低;有98个蛋白质表达差异点,其中76个蛋白质斑点上调,22个蛋白质斑点下调;对其中上调的20个蛋白质斑点进行了质谱鉴定,发现细胞间叶来源的中间丝蛋白Vimentin在存活克隆CNE1-15GyR中表达增高。结论照射筛选的存活克隆CNE1-15GyR与亲本细胞株CNE1相比生物学性状发生了改变,细胞间叶来源的中间丝波形蛋白Vimentin在CNE1-15GyR克隆中表达增高,可能与G/G期比例增高有关。

真核细胞质膜蛋白质组研究进展

细胞膜(质膜)蛋白质是细胞的“门铃”与“门户”,是许多药物的作用靶标。细胞质膜蛋白质组的研究正成为蛋白质组研究的热点,这方面的研究有利于具有重要功能的低丰度蛋白质的发掘, 为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而,质膜蛋白质组的研究在强疏水性跨膜蛋白质和低丰度膜蚩白质的分离和鉴定上遇到了方法学的挑战。本文对质膜及其微区的纯化、质膜蛋白质组的分离与鉴定、生物信息学,以及亚细胞定位研究的近期进展作扼要介绍。

质谱技术分析多发性骨髓瘤患者血清差异蛋白

目的应用双向电泳(2-DE)和质谱技术分析多发性骨髓瘤(MM)患者血清中的差异表达蛋白,寻找MM特异性蛋白标记物。方法收集MM患者5例、其他血液系统恶性肿瘤患者及正常对照者血清各10例,三组样本等体积混合,去除高丰度白蛋白和IgG,应用2-DE分离3组血清样本,凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白质点,以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白质点进行鉴定。结果通过凝胶软件分析MM与疾病对照组及正常对照组血清2-DE图谱,共得到51个三倍以上差异蛋白点,对上述差异蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析,共鉴定出22种阳性蛋白,其中13种蛋白表达上调,包括高表达蛋白如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RIO1亚型2、Rab相关蛋白Rab37亚型2、HP蛋白、锌指结构α2糖蛋白等;9种蛋白表达下调,包括α2-HS-糖蛋白、转铁蛋白、多聚素-1等。结论 MM组与疾病对照组和正常对照组间存在差异表达的蛋白质,这些差异蛋白有助于MM早期诊断和鉴别诊断,并为MM发病机制的进一步研究提供线索。

蛋白质组学技术在植物类囊体膜蛋白研究中的应用

类囊体作为植物光合作用光反应的重要场所,在植物亚细胞蛋白质组学研究中倍受关注。介绍了植物蛋白质组学相关技术,包括双向凝胶电泳(2DE)、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、质谱(MS)和蛋白质组学数据库在植物类囊体膜蛋白研究中的应用。同时对类囊体膜蛋白质组学的研究趋势进行了探讨。

植物蛋白质组学研究进展

植物结构蛋白质组学研究目的在不断变化。早期旨在比较不同基因型和株系,估测系统发育距离。随后是用蛋白N端Edman测序法或氨基酸分析法鉴定蛋白。如今,应用双向凝胶电泳和质谱法,已能联手成功地解决蛋白分离和鉴定问题。这将有助于对不同突变系与野生型作比较和对不同的表达基因鉴定,应用数据库和作图软件有可能获得功能蛋白构象。

定量蛋白质组学研究的技术体系

从蛋白质组水平上对基因表达进行准确的定量分析,是比较蛋白质组学的重要内容,是研究重大疾病致病机制以及药理控制机制的必要手段。定量分析蛋白质组的方法主要包括:2DE结合串联质谱技术,稳定同位素标记技术等。

卵巢癌组织的差异蛋白质研究

目的分析卵巢癌患者癌组织、癌旁组织及正常卵巢黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离卵巢癌患者配对癌组织、癌旁组织及正常卵巢黏膜组织的总蛋白,银染显色,PDQuest2DE软件分析差异表达的蛋白质点;凝胶经银染显色后,Bio-Rad凝胶扫描仪扫描,Imagemaster图像软件分析,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离-两级飞行时间串联质谱法进行鉴定。结果获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱。3组胶的平均匹配率分别为:癌组织83.4%、癌旁组织81.2%、正常卵巢黏膜组织88.1%。斑点位置偏差等电聚焦方向上为(1.21±0.27)mm,SDS-PAGE方向上为(1.03±0.28)mm。差异分析共获得164个差异表达的蛋白质点;有差异性表达的8种蛋白质中有4种为结合珠蛋白的亚型。结论双向凝胶电泳-质谱技术能分离卵巢癌组织的总蛋白,并获得重复性较好的结果;结合珠蛋白能为诊断卵巢癌提供诊断手段。

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。

应用比较蛋白组学技术筛选乳腺癌血清标志物

为了寻找乳腺癌血清标志蛋白标志物,本研究用试剂盒去除血清样品中的高丰度蛋白,通过固相pH梯度双向凝胶电泳分离乳腺癌病人血清和非乳腺癌血清,银染显色,分析比较电泳图谱寻找差异蛋白.用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定差异蛋白的肽指纹图谱,MASCOT软件分析确定为何种蛋白,然后用蛋白印迹验证与乳腺癌发生关系密切的差异蛋白.本研究获得了分辨率高、重复性好的双向电泳银染图谱,得到3个差异明显的蛋白,经肽指纹分析并结合数据库查询,初步鉴定为人血凝级联反应中的关键酶、人体细胞凋亡蛋白抑制剂样蛋白ILP-2、人体HP蛋白.蛋白印迹研究表明ILP-2在乳腺癌血清中的含量明显高于非乳腺癌血清样本,该蛋白有可能是乳腺癌标志物.

水牛卵母细胞成熟前后的差异蛋白质组的分析

本试验以水牛卵母细胞为研究对象,通过基于双向电泳-质谱技术的蛋白质组学研究手段,鉴定卵母细胞成熟前后表达量存在变化的蛋白质并进行验证。通过优化方法建立水牛卵母细胞蛋白质双向电泳分离的技术体系,通过双向电泳(2-DE)获得成熟前后的卵母细胞蛋白质电泳图谱,软件分析得到差异表达蛋白质,对差异蛋白质进行飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析,部分差异蛋白质合成抗体进行Western blot验证。结果表明,2组卵母细胞样品均获得约300个蛋白质斑点的双向电泳图谱。经ImageMaster软件比对分析,共发现在水牛卵母细胞成熟前后有27个差异蛋白质,其中表达上调15个,表达下调12个。将差异蛋白质斑点胶内酶解后用于MALDITOF/TOF飞行时间质谱鉴定,成功鉴定了6个蛋白质,包括主要穹窿蛋白(MVP)、热激蛋白60(HSP60)、Ras应答结合原件蛋白1(RREB1)等。Western blot结果表明,HSP60蛋白表达与双向电泳结果一致。本试验发现一批在卵母细胞成熟前后的差异表达蛋白质并进行表达量验证,推测HSP60蛋白可能在体外成熟时起到保护卵母细胞和物质转运的作用。