基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。

以耐草甘膦2mG2-epsps基因为选择标记的玉米转化体系的建立

转化细胞的筛选和再生是植物遗传转化体系中重要的组成部分,筛选剂的选择和筛选压力的高低直接影响着外源基因的转化率。以草甘膦异丙胺盐为筛选剂,通过比较在不同的草甘膦浓度及筛选时间的条件下,玉米愈伤组织生长和分化情况,发现经1mM的草甘膦异丙胺盐筛选15d后玉米愈伤组织分化受到明显抑制,故以此作为玉米遗传转化实验中的筛选压力。通过基因枪轰击,将构建好的pMAGUHM载体(其上携带有抗草甘膦基因2mG2-epsps基因)转化到玉米愈伤组织,利用草甘膦筛选得到耐草甘膦植株80株,其中PCR检测阳性植株为36株,转化率为45%。

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT-PCR、Western杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03μg/g鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。

通过玉米茎尖转化耐草甘膦基因2mG2-epsps及抗性鉴定

以X2211、78599等10个优良玉米自交系的茎尖为受体材料,采用农杆菌介导和真空负压法将抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米茎尖生长点分生组织细胞,转化后的茎尖经共培养3 d,植入花盆,3叶1心经除草剂（glyphosate,草甘膦）筛选,产生耐草甘膦1‰~1.25‰植株,移栽大田。从种子萌发准备茎尖到转化苗喷施除草剂筛选、移栽大田,整个周期只需30 d左右。同时,经特异PCR检测表明：2mG2-epsps基因已整合进部分植株。

转2mG2-epsps基因耐草甘膦玉米T抗-4对非靶标除草剂的耐受性评价

【目的】以优异的耐草甘膦转基因玉米转化体T抗-4和未转化的受体自交系18599为材料,开展T抗-4综合农艺性状评价以及对非靶标除草剂的耐受性评价。【方法】对田间主要农艺性状表型及产量性状进行调查和分析。【结果】T抗-4主要农艺性状与18599相比,在植物形态学上基本无差异。本研究选取常规玉米田间普遍施用的除草剂烟嘧磺隆和硝磺草酮-莠去津,常规玉米敏感的除草剂精喹禾灵以及非选择性、灭生性除草剂草铵膦作为非靶标除草剂,通过人工喷施1和2倍的田间推荐剂量,在田间受控环境下评价T抗-4对非靶标除草剂的耐受性表明:上述非靶标除草剂对受体植株18599和玉米转化体T抗-4的影响表现一致。【结论】第一,转化体和非转基因对照除了在目标性状草甘膦抗性方面具有显著差异之外,非靶标除草剂的耐性表现具有等同性;第二,在农业生产中,耐草甘膦的转基因玉米T抗-4可以通过常规的玉米敏感除草剂精喹禾灵和非选择性除草剂草铵膦进行防治和杀灭,保障了转化体的环境安全。本试验为玉米转化体T抗-4的环境等安全评价提供了基础试验数据。

洁净DNA转化获得2mG2-epsps基因单拷贝整合的抗草甘膦水稻

洁净DNA转化是基因枪介导外源基因表达框导入植物的转化技术,能从根本上消除载体框架序列对转基因植株的不利影响。2mG2-epsps基因是具有重要育种价值的草甘膦除草剂抗性基因。以日本晴为材料,研究了草甘膦对水稻愈伤组织生长及分化的影响,采用洁净DNA转化技术将2mG2-epsps基因表达框导入水稻。结果表明：1）草甘膦对水稻愈伤组织的生长及分化有明显的抑制作用,当草甘膦浓度为2mmol/L时,愈伤组织绿苗分化率为18.97%,较对照71.67%显著降低。2）基因枪介导2mG2-epsps基因表达框转化水稻时,经草甘膦筛选获得抗性愈伤后,在植株再生培养基中去除筛选剂利于抗性愈伤的分化,转化率为17.20%。经Southern杂交分析,2mG2-epsps基因表达框均以单拷贝整合到受体基因组。52.17%（12/23）转基因株系可耐受12~50mmol/L的草甘膦。

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。

植物Mg^(2+)转运蛋白与相关基因及其功能的研究进展

镁离子是植物细胞中最丰富的二价阳离子,在植物的生长发育中起着重要的作用.对Mg2+独特的几何和化学性质,Mg2+对植物细胞体内中动态平衡的影响,植物中Mg2+转运相关蛋白与相关基因及其功能的研究进展进行了综述.

血管紧张素Ⅱ对大鼠心肌肌浆网Ca^(2+),Mg^(2+)-ATPase基因转录调节的影响

观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）对心肌肌浆网Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｅ基因（ＳＥＲＣＡ２ａ）转录调节的影响，评价ＤＭＰ８１１对此效应的干预作用．６周龄雄性ＳＤ大鼠随机分为３组，每组６只．组１：生理盐水输注；组２：ＡｎｇⅡ输注＋ＤＭＰ８１１管饲（３ｍｇ·ｄ－１·ｋｇ－１）；组３：ＡｎｇⅡ输注（２００ｎｇ·ｍｉｎ－１·ｋｇ－１．１周后称其体重，取心脏并称重，提取心脏总ＲＮＡ后采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ的方法检测ＳＥＲ－ＣＡ２ａ的转录水平，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡｎｇⅡ１型受体（ＡＴ１）ｍＲＮＡ水平．实验后，组３心重（ＣＷ）、心重／体重（Ｃ／Ｂ）、ＡＴ１受体转录水平均高于组１（分别增加４．７±０．４％，４．９±０．９％和２４．７±３．５％；Ｐ＜０．０１），而ＳＥＲＣＡ２ａ基因转录水平显著低于组１（降低２０．１±３．０％，Ｐ＜０．０１），并且ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平与ＡＴ１受体ｍＲＮＡ水平呈负相关（ｒ＝－０．７４，Ｐ＜０．０１）．ＡｎｇⅡ导致的上述改变能被ＤＭＰ８１１完全阻断．ＡｎｇⅡ通过其Ⅰ型受体的介导。

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。

玉米胚性愈伤组织的遗传转化及耐草甘膦植株再生

以优良玉米自交系X2211的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法将来自微生物荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2菌株的抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米愈伤组织细胞,转化后的细胞经草甘膦筛选,获得抗性愈伤组织并再生植株282株,成活86株,经特异PCR检测表明其中26株植株转入了2mG2-epsps基因,喷施0.125%除草剂试验检测表明,转基因植株具有良好的耐除草剂特性,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的亲本材料。

抗虫/耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化

随着植物基因工程的发展,将多个基因转化植株已成为研究的热点之一,利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。利用连接多肽2A和LP4/2A分别将抗虫基因Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)cry1Ah和耐草甘膦基因mG2-epsps连接起来,构建了4个融合基因表达载体pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH和两个单基因载体pSAh、pSmG2,其中pHAG、pHLAG是Bt cry1Ah基因在前,mG2-epsps基因在后,pGAH、pGLAH是mG2-epsps基因在前,Bt cry1Ah基因在后,分别用2A和LP4/2A作为连接肽,由CaMV35S启动子驱动。利用农杆菌介导法将6个植物表达载体转入烟草,得到再生植株529株。经PCR检测,有261株再生苗为阳性植株,转化率达到49.3%。获得的转基因烟草可用于分析连接肽2A和LP4/2A的剪切效率以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响。