SOCS3基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定

目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3'端非翻译区(3'-un-translated region,3'-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3'-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3'-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。

3′端非翻译区影响TNFα cDNA在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法改变了表达构建物pRL-rhTNF中的结构,即去掉rhTNFαcDNA3＇端非翻译区序列110bp(命名为pRL-rhTNFα2),转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL-rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3＇端非翻译区的pRL-rhTNFα2能稳定表达rhTNFα,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高,提示3＇端非翻译区序列对表达有影响。3＇端非翻译区内存在一个相似于TA的重复序列——TTTA TTA七聚体。这可能是本研究中影响TNFα表达量的原因之一。

关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P<0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。

AKT2 3'-UTR荧光素酶报告基因载体构建及与miRNA-625靶向关系验证

目的:通过构建荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系。方法:通过生物信息学软件预测AKT2为miRNA-625靶基因;构建野生型AKT2基因3'端非翻译区荧光素酶报告基因载体及miRNA-625靶序列突变型载体;将HEK-293T细胞株随机分为野生型+miRNA-625组、野生型+miRNA内参组、突变型+miRNA-625组、突变型+miRNA内参组;Lipofectamine 2000转染相应的质粒与miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:构建野生型及突变型荧光素酶报告载体鉴定正确,双荧光素酶报告基因检测系统显示野生型+miRNA-625组相对荧光素酶活性较野生型+miRNA内参组明显降低(t=14.176 4,P<0.05)。结论:miRNA-625对野生型AKT2重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miRNA-625能够靶向调控AKT2基因。

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P<0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。

豌豆肌动蛋白异型体的表达与系统发生分析(英文)

豌豆 (PisumsativumLinn .)肌动蛋白基因至少可以分为 3类异型体 :PEAcⅠ、PEAcⅡ和PEAcⅢ ,它们的编码区序列相似性很高 ,而非编码区序列存在显著的差异。RT_PCR和以 3′端非翻译区作探针的Southern杂交结果显示豌豆肌动蛋白异型体基因在根、茎、叶、卷须、花粉和幼嫩果实中均表达 ,但表达强度存在明显差异。利用连续稀释电泳对PEAcⅠ的转录本水平进行分析后发现它倾向于在幼嫩的器官中表达 ,且在 7d的茎中表达最强 ;在一个月内的叶片中表达也较强 ,此后明显下降 ;卷须中表达变化不显著 ,在花粉中表达很弱 ,在幼嫩荚果中的表达亦较多。PEAcⅡ表达特点与PEAcⅠ具有某些相似性。根据肌动蛋白序列重建的系统发生树表明豌豆肌动蛋白 3类异型体间的分歧明显 ,但起源于单、双子叶植物分化前的共同基因祖先。推测豌豆肌动蛋白异型体基因在转录调控和细胞功能上存在差异。

miR-29a靶基因ITGβ_1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ_1基因靶向调控的作用。方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成c DNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ_1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p MIR-Report上,构建出p MIR-ITGβ_1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定。将p MIR-Report Luciferase载体,所构建的p MIR-ITGβ_1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ_1的作用机制。结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建p MIR-ITGβ_1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ_1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达。结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达。

COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与miR-299靶向关系验证

目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299(miR-299)与Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础.方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3'UTR区(3'端非翻译区)的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3'UTR野生和突变序列,将其克隆至psiCHECK-2质粒中构建相应载体,载体鉴定采用酶切法和基因测序法.细胞复苏、扩增并转染,转染分4组,每组3孔,分别为:①COL4A3-WT加miR-299/NC.②COL4A3-WT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor.③COL4A3-MUT加miR-299/NC.④COL4A3-MUT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor;采用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性并行t检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义.结果酶切及DNA测序结果显示psiCHECK-2-COL4A3双荧光素酶报告基因载体构建成功.Luciferase检测显示:野生型COL4A3基因组间比较,miR-299转染组(R/F均值为59.38%)较NC组(R/F均值为100%)荧光素酶活性下降,组间差异有统计学意义(P<0.05);野生型COL4A3基因加inhibitor后组间比较,miR-299-inhibitor组(R/F均值为153.98%)较NC-inhibitor组(R/F均值为100%)荧光素酶活性上升,组间差异有统计学意义(P<0.05);突变型COL4A3基因组及突变型组加入inhibitor后组间比较,miR-299转染组(R/F均值为102.09%)及miR-299-inhibitor组(R/F均值为108.51%)较对应NC组(R/F均值为104.70%)及NC-inhibitor组(R/F均值为105.13%)比较,荧光素酶活性差异均无统计学意义(P>0.05).结论COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-299直接作用于靶基因COL4A3-3'UTR区域的真实性.