比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

天然产物3'-prenylgenistein的全合成

3'-prenylgenistein是从大豆中分离出来的新型异戊烯基异黄酮,该化合物具有重要的生物防御活性。以廉价的4-羟基苯甲醛和2,4,6-三羟基苯乙酮为起始原料,通过异戊烯基化、羟基保护、羟醛缩合、环化以及黄烷酮到异黄酮的重排等步骤,首次以13.4%的总产率完成了天然产物3'-prenylgenistein的全合成。所有新化合物的结构都经过核磁共振(1H NMR)、红外光谱(IR)和质谱(MS)确认。

关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P<0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。

酶催液中3'-唾液酸乳糖分离提纯方法研究

3’-唾液酸乳糖(3’-SL)是一种功能性母乳寡糖,在新生儿的免疫防御、炎症保护、肠道微生态构建中发挥重要作用。近年来,研究者通过构建特定酶系,实现3’-唾液酸乳糖的高产量酶催合成。以酶催反应液为原料,利用膜联用技术和脱色脱盐技术,对酶催液中的3’-唾液酸乳糖进行分离纯化,优化条件及结果如下:90℃热处理后过30nm膜超滤,压力250 kPa,滤洗2次;调定p H10.0后过3 000 Da膜超滤,压力600 kPa,滤洗5次;两步超滤下,蛋白截留率98.7%,目标物回收率87.4%。pH调至中性后过1 000 Da膜纳滤,压力1.9 MPa,滤洗7次,乳糖去除率达到90.7%。活性炭(ZX-305型)添加量1.2%,处理温度55℃,脱色率达到86.3%。离子交换树脂(001×7型和D315型)洗脱速率0.5 BV·h-1,料液3’-唾液酸乳糖浓度10 g·L^(-1),脱盐率达到94.1%,浓缩干燥后样品粉末纯度达到95%~97%(以干物质计)。样品通过液质联用仪、傅里叶红外光谱仪进行结构鉴定,确认为3’-唾液酸乳糖。

3'-大豆苷元磺酸钠对豚鼠离体右心房自律性及收缩特性的影响

目的研究3'-大豆苷元磺酸钠对豚鼠离体右心房自律性及收缩特性的影响,并探讨其作用机制。方法采用豚鼠离体右心房测定3'-大豆苷元磺酸钠对其自律性、收缩幅度、收缩速度、舒张速度的影响。结果3'-大豆苷元磺酸钠可降低豚鼠离体右心房的自律性,明显降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度,且具有明显的剂量依赖性。结论3'-大豆苷元磺酸钠可抑制豚鼠离体右心房的自律性,明显降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度,且具有明显的剂量依赖性。其作用机制可能与阻断电压依赖性Ca2+通道及抑制肌浆网对Ca2+的释放有关。

3,4-双(3'-氨基呋咱-4'-基)呋咱的合成与表征

以3-氨基-4-酰氯肟基呋咱(AAOF)为原料,经分子间二聚生成3,4-二氨基呋咱基氧化呋咱(DATF),DATF还原生成了新化合物3,4-双(3'-氨基呋咱-4'-基)呋咱(BATF),总收率为54%,采用红外光谱、核磁共振光谱、质谱、元素分等进行了结构表征。通过质谱裂解碎片,研究了BATF的碎裂反应机理;探讨了还原反应关键影响因素,确定了最佳的反应条件为:还原剂为SnC l2/HC l/AcO H,料比n(还原剂)n(DAT F)为31～41,反应温度为75℃,时间为7 h。

HPLC法测定不同产地黄蜀葵花中金丝桃苷异槲皮苷及槲皮素-3'-葡萄糖苷含量

目的测定不同产地黄蜀葵花药材中金丝桃苷,异槲皮苷,槲皮素-3'-葡萄糖苷含量。方法高效液相色谱法。色谱柱:Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-甲醇(10∶1)-0.4%磷酸,梯度洗脱;检测波长:360nm;柱温:室温;流速:1.0ml/min。结果江苏江堰黄蜀葵花中金丝桃苷含量1.12%,RSD为1.54%;异槲皮苷含量0.68%,RSD为1.58%;槲皮素-3'-葡萄糖苷含量0.59%,RSD为1.47%;江苏兴化黄蜀葵花中金丝桃苷含量0.98%,RSD为1.49%;异槲皮苷含量0.60%,RSD为1.62%;槲皮素-3'-葡萄糖苷含量0.52%,RSD为1.55%;河北邢台黄蜀葵花中金丝桃苷含量1.03%,RSD为1.72%;异槲皮苷含量0.62%,RSD为1.84%;槲皮素-3'-葡萄糖苷含量0.54%,RSD为1.62%。结论江苏江堰黄蜀葵花中金丝桃苷,异槲皮苷,槲皮素-3'-葡萄糖苷含量均最高,江苏兴化黄蜀葵花中金丝桃苷,异槲皮苷,槲皮素-3'-葡萄糖苷含量均最低,该方法简便,准确,重现性好,为各地黄蜀葵花药材的进一步开发利用提供质量控制依据。

3'-大豆苷元磺酸钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的研究3'-大豆苷元磺酸钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用,并初步探讨其保护机制。方法大鼠大脑中动脉栓塞,制作脑缺血再灌注损伤模型,缺血后10 min,于舌下静脉给予不同剂量的3'-大豆苷元磺酸钠。再灌注24 h后,断头取脑,做TTC染色,测定脑梗死体积,另一组取血,离心后,取血清,测定血清一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及一氧化氮(NO),丙二醛(MDA)的含量。结果与模型组相比,各剂量的3′-大豆苷元磺酸钠治疗组脑梗塞体积减小;3'-大豆苷元磺酸钠治疗组血清NOS和SOD的活性升高,NO含量升高,MDA含量降低。结论 3'-大豆苷元磺酸钠对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,其保护机制与3'-大豆苷元磺酸钠促进NO释放及增强氧自由基的清除有关。

芜菁类黄酮3'-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3'-羟化酶(Flavonoid 3'-hydroxylase,F3'H)是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁Br F3'H1和赤丸芜菁Br F3'H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了Br F3'H1和Br F3'H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,Br F3'H1P和Br F3'H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用Br F3'H1P和Br F3'H2P序列替换p CAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,Br F3'H1P和Br F3'H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了Br F3'H1P和Br F3'H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,Br F3'H1P和Br F3'H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。Br F3'H1和Br F3'H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3'H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。

3'-大豆苷元磺酸钠抗心律失常作用研究

目的:研究3'大豆苷元磺酸钠的抗心律失常作用。方法:采用常规抗心律失常方法。结果:3'大豆苷元磺酸钠3.0、5.0、10.0mg/kg对氯仿诱发的小鼠室颤有明显的预防作用,0.5、1.0、3.0mg/kg对乌头碱诱发的大鼠心律失常有明显的治疗效果,0.5、1.0mg/kg能对抗肾上腺素诱发的家兔心律失常,0.5、1.0、3.0mg/kg对氯化钙诱发的大鼠室颤具有预防作用,且能明显的降低大鼠的死亡率。以上作用均具有明显的剂量依赖性。结论:3'大豆苷元磺酸钠具有明显的抗心律失常作用,其抗心律失常作用可能与其抑制Na+、Ca2+内流以及与阻断β肾上腺素受体有关。

2,4,4'-三羟基脱氧安息香-3'-磺酸钴的合成、晶体结构表征及性质研究

合成了未见文献报道的水溶性很好的2,4,4'-三羟基脱氧安息香-3'-磺酸钴,采用IR,UV,1HNMR和元素分析对其进行了表征,并利用X射线单晶衍射仪测定了该化合物的晶体结构.使用荧光光谱法检测了化合物对羟基自由基的清除作用,紫外光谱法检测其对超氧自由基的清除作用.实验结果表明,2,4,4'-三羟基脱氧安息香-3'-磺酸钴[C28H46CoO26S2]属于单斜晶系,空间群C2/c,a=3.3937(3)nm,b=0.85180(7)nm,c=1.37455(11)nm,α=90°,β=97.8200(10)°,γ=90°,Z=4,V=3.9365(5)nm3,Dc=1.555g/cm3,F(000)=1924,R1=0.0329,wR2=0.0852,具有较好的清除羟基自由基和超氧自由基的作用.

2',3'-二脱氧-2',3'-二去氢鸟嘌呤核苷构象稳定性的理论研究

采用密度泛函方法在B3LYP/6-31+G**水平上研究了2',3'-二脱氧-2',3'-二去氢鸟嘌呤核苷分子(D4G)的构象.分别研究在气相中的孤立分子和一水合物异构体的相对稳定性和异构体之间的相互转变过程,分析了水分子的参与对D4G异构体的相对稳定性和几何结构参数以及自然电荷的影响.结果表明,孤立的D4G分子在气相中存在8种稳定构象,其中构象d4g-2是所有构象中最稳定的,气相中D4G主要以d4g-2存在.气相中各构象的相对稳定性为:d4g-2>d4g-1>d4g-5>d4g-3>d4g-6>d4g-4>d4g-8>d4g-7.计算得到的各构象键长和键角数据与实验值接近.一个水分子的加入对D4G分子的构型参数有所影响,基本不改变D4G分子各构象的稳定性顺序,但构象转变的能垒有所提高.氢键在分子构象中发挥了重要作用.

3'-大豆苷元磺酸钠抑菌活性初步研究

目的:研究3'-大豆苷元磺酸钠的抑菌活性。方法:通过滤纸片对3'-大豆苷元磺酸钠进行了抑菌试验。结果:3'-大豆苷元磺酸钠溶液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑菌效果,随着浓度增加,抑菌作用增强。结论:3'-大豆苷元磺酸钠对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌作用。

3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞及PTEN基因的影响

目的通过观察3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞(PC-3)增殖和相关基因表达的影响,探讨预防前列腺癌发病的新药物。方法将PC-3在F12培养基(含10%小牛血清)中采用开放式单层贴壁培养,实验设溶剂对照组、受试物各6个剂量组,采用MTT法对PC-3的增殖情况进行分析,对3'-大豆苷元磺酸钠作用后的雄激素非依赖型前列腺癌(PC-3)细胞的存活率、细胞毒作用进行了研究。结果与双蒸水对照组相比,3'-大豆苷元磺酸钠对PC-3细胞抑制效应具有剂量依赖性,具有诱导前列腺癌细胞(PC-3)凋亡和引起坏死效应,同时诱导PC-3细胞的(PTEN基因)表达。结论3'-大豆苷元磺酸钠具有明显抑制前列腺癌细胞PC-3增殖效应,并呈剂量依赖性。

3'-大豆苷元磺酸钠对H_2O_2诱导大鼠心肌成纤维细胞衰老的影响

目的:观察氧化应激对心肌成纤维细胞(CFb)衰老的影响以及3'-大豆苷元磺酸钠(DSS)的干预作用,初步探讨3'-大豆苷元磺酸钠抗心脏老化过程中心肌纤维化的机制。方法:差速贴壁法培养SD乳鼠心肌成纤维细胞,MTT法检测细胞增殖能力,硝酸还原酶法检测细胞上清液NO含量,采用免疫细胞化学染色检测心肌成纤维细胞的-平滑肌肌动蛋白(-SMA)表达,用吖啶橙荧光染色检测细胞的衰老。结果:在H2O2刺激下,心肌成纤维细胞增殖率降低,-SMA免疫化学染色出现明显强阳性,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),NO含量与正常组比较明显降低(P<0.01),3'-大豆苷元磺酸钠3种浓度均具有延缓H2O2诱导的以上效应,与H2O2刺激组比较有显著性差异(P<0.05;P<0.01)。结论:3'-大豆苷元磺酸钠通过抑制氧化应激加速心肌成纤维细胞的衰老,恢复心肌成纤维细胞正常增殖能力,其作用机制可能是通过影响NO系统以及受体机制来抑制心肌成纤维细胞表型转化,这也可能是3'-大豆苷元磺酸钠抗心肌肥厚的机制之一。

3'-大豆苷元磺酸钠对豚鼠胆囊收缩运动的影响

目的:研究3'-大豆苷元磺酸钠对胆囊收缩运动的影响。方法:通过对豚鼠胆囊肌条观察3'-大豆苷元磺酸钠拮抗组胺所致胆囊收缩运动、拮抗高K+所致胆囊收缩运动、拮抗Ca2+引起豚鼠离体胆囊收缩运动、拮抗乙酰胆碱所致胆囊收缩运动的影响。结果:3'-大豆苷元磺酸钠可明显拮抗组胺、高K+所致胆囊收缩运动及拮抗累积Ca2+引起豚鼠离体胆囊收缩运动,但对乙酰胆碱所致胆囊收缩运动无影响。结论:3'-大豆苷元磺酸钠可明显拮抗组胺、高K+、Ca2+引起豚鼠离体胆囊收缩。

水稻类黄酮3'-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3'H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3'H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3'H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3'H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3'H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3'H基因,进一步研究F3'H基因功能奠定基础。

花旗松素和3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用

目的探讨从红蓼成熟果实中分离出来的花旗松素和3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对人体肿瘤细胞的增殖抑制作用。方法用结晶紫染色法检测花旗松素和3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对人胃癌MGC细胞、人肝癌HepG-2细胞和人盲肠癌Hce-8693细胞的增殖抑制作用。结果花旗松素和3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在1～500μg/mL质量浓度范围内对MGC细胞、HepG-2细胞和Hce-8693细胞均有一定的生长抑制作用,随着剂量的增大和作用时间的延长,呈较好的剂量-时间-效应关系;同等条件下,花旗松素比3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的抑制作用强。结论花旗松素与3,3'-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷均有体外抗肿瘤活性,能抑制MGC细胞、HepG-2细胞和Hce-8693细胞的增殖。

3'-(叔丁基二甲基硅氧)-苯并噁嗪利福霉素的合成

众所周知,结核病是一种常见的、多发的、古老而现代的慢性传染病,系世界三大传染病之一,严重危害人类的健康。利福霉素类抗生素,诸如利福平、利福喷丁及利福布汀等抗结核药物,在防痨抗痨中发挥着极为重要作用,但在结核病的治疗过程中却逐渐出现耐药性及交叉耐药性,

3,3'-二硝胺基-4,4'-偶氮呋咱二胍盐的合成、晶体结构及性能

以二氨基呋咱(DAF)为原料,经氧化、硝化、复分解反应,合成出3,3'-二硝胺基-4,4'-偶氮呋咱二胍盐(G2DNAAF),总收率为64%。采用核磁共振谱、红外光谱、元素分析和X-射线单晶衍射分析对其结构进行了表征。结果表明:G2DNAAF属于单斜晶系,空间群P2(1)/n,a=5.226(2),b=12.686(5),c=11.944(5),α=90°,β=92.896(7)°,γ=90°,V=790.8(5)3,Z=2,D-1c=1.698 g·cm-3,μ=0.148 mm,F(000)=416。差示扫描量热分析表明G2DNAAF的热分解峰温为259.0℃。Gaussian 09和KamletJacbos公式计算结果表明,G2DNAAF的固相生成焓为588.27 kJ·mol-1,爆速为7.839 km·s-1,爆压为26.81 GPa。