多酶催化合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应体系的构建及优化

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是目前发现的唯一的"活性"硫酸基团供体,在生物肝素酶法硫磺化反应中起到重要作用,但化学合成的成本高。如何大量低成本制备PAPS是实现酶法合成肝素工业化的关键因素。本文克隆表达了酶法合成PAPS的两个酶:三磷酸腺苷(ATP)硫化酶和5’-腺苷磷酰硫酸(APS)激酶。构建了一条体外合成PAPS的途径。首先利用ATP硫化酶将ATP转化生成APS,同时产生副产物无机焦磷酸(PPi),APS再在APS激酶作用下转化生成PAPS。研究了Mg2+浓度、缓冲体系和p H、温度以及无机焦磷酸水解酶(PPase)的添加对该酶反应的影响。通过添加无机焦磷酸水解酶(PPase),极大提高了PAPS的转化率。在最优条件下考察不同ATP浓度下PAPS随时间的积累量变化,发现反应过程中存在底物抑制作用;ATP浓度为50 mmol?L?1时,反应25 h,PAPS的积累量为18.87 mmol?L?1。反应过程中分批补料ATP,能极大提高催化效率。反应11.5 h,PAPS积累量可达20.36 mmol?L?1(10.32 g·L?1),转化率为81.4%。

多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸的高效合成及其应用

硫酸化化合物广泛存在于胞浆、细胞表面及胞外基质中,在机体细胞发育、分化、免疫、解毒和信号传递等生命活动过程中起着不可替代的作用。3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(3?-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate,PAPS)是化合物硫酸化过程中最常用的硫酸基供体,但目前合成PAPS并最终实现其工业化应用还困难重重。文中主要综述过去10年内关于PAPS的生物合成及应用的研究进展,以期为PAPS的合成及其在芥子油苷、肝素、硫酸软骨素及羟胺硝喹等的生物合成中的应用提供参考。

嘌呤核苷酸代谢与恶性肿瘤关系的研究进展

核苷酸是多种生命活动所必须的有机小分子,嘌呤核苷酸的合成和分解代谢异常是一些疾病产生的基础,也是其治疗的靶点。肿瘤的发生、发展涉及大量的病理生理学过程,包括嘌呤核苷酸代谢失衡。参与嘌呤核苷酸合成代谢和分解代谢的多种酶与肿瘤细胞的增殖、耐药有关,尿酸抗氧化特性和促炎特性的失衡也可诱发肿瘤并促其进展。异常的嘌呤核苷酸代谢可通过调节信号转导通路影响基因和蛋白的表达,促进细胞恶性转化、侵袭和转移,且不同肿瘤患者的核苷酸代谢特点不完全相同。本文简要综述了嘌呤核苷酸代谢与恶性肿瘤关系的基础研究和流行病学研究进展,旨在为恶性肿瘤的预防、治疗及预后判断提供依据。

PAPST1 siRNA抑制髓母细胞瘤细胞系DAOY增殖活性的研究

目的研究3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸转运体1(adenosine-3-phospho-5-phosphosulfate transporter 1,PAPST1)在髓母细胞瘤中的表达情况,探讨其对髓母细胞瘤细胞系增殖活性的影响。方法采用qRT-PCR法检测25例髓母细胞瘤标本、1例原代培养髓母细胞瘤细胞、3例髓母细胞瘤细胞系PAPST1表达,并与正常小脑组织比较,利用免疫组织化学检测PAPST1在髓母细胞瘤中的表达分布,采用PAPST1 siRNA处理髓母细胞瘤细胞系DAOY,利用qRT-PCR、Western blot法检测PAPST1表达变化,CCK-8法检测处理后的DAOY细胞系增殖活性。结果与正常小脑组织相比,PAPST1在18/25(72%)的髓母细胞瘤标本及DAOY、ONS-76细胞系中呈2倍以上的高表达,免疫组化显示PAPST1定位于细胞质中,且染色明显强于正常小脑组织,PAPST1 siRNA在mRNA及蛋白的水平明显干扰了PAPST1的表达(P<0.05),DAOY细胞的增殖活性受到明显抑制(P<0.05)。结论 PAPST1在髓母细胞瘤中有广泛的高表达,下调PAPST1的表达可以降低髓母细胞瘤细胞的增殖活性。

cAMP对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨3',5'-环化腺苷一磷酸(c AMP)对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响,并进一步证明分子机制。方法复制高血压鼠模型,提取血管平滑肌细胞。噻唑蓝比色(MTT)法检测db-c AMP对正常鼠和高血压鼠在对照组、db-cAMP组和腺苷酸环化酶激活剂Forskolin(FSK)组血管平滑肌细胞活性的影响。Western blot法检测不同浓度的db-c AMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞中抑制性蛋白α亚基2(Giα2)和抑制性蛋白α亚基3(Giα3)蛋白表达以及对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白和原癌基因(c-Src)蛋白磷酸化水平的影响。流式细胞仪检测不同浓度的db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞内活性氧(ROS)生成的影响。结果在正常鼠中,与对照组的细胞活性水平相比,db-c AMP组和FSK组的细胞活性水平差异无统计学意义(P>0.05)。在高血压鼠中,与对照组的细胞活性水平比较,db-c AMP组和FSK组的细胞活性水平差异有统计学意义(P <0.05),db-cAMP组和FSK组均下降;与正常鼠不添加db-c AMP比较,高血压鼠不添加db-c AMP的血管平滑肌细胞中Giα2和Giα3的蛋白表达增加,超氧阴离子O2-生成,EGFR蛋白、ERK1/2蛋白和c-Src蛋白的磷酸化水平均增加。与正常鼠不添加db-cAMP比较,正常鼠添加0.5 mmol/L db-cAMP的血管平滑肌细胞中上述参数部分差异有统计学意义(P <0.05)。与高血压鼠不添加db-cAMP相比,在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和1 mmol/L db-cAMP后上述参数均降低,差异有统计学意义(P <0.05)。结论初步认为db-cAMP可能通过抑制细胞中Giα蛋白的表达、氧化应激水平及下游信号通路,从而抑制高血压鼠血管平滑肌细胞增殖。

嘌呤能离子通道型受体7及其在周围神经再生中的作用

在周围神经系统的神经节内,神经元胞体被周围的卫星胶质细胞包裹形成神经结构功能单元,而嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)是卫星胶质细胞膜上的一个腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)门控的非选择性离子通道,有研究表明,P2X7R可促进细胞增殖和促进神经轴突生长,也有研究报道,其被激活后可导致环氧化酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等炎症介质的释放,介导细胞的损伤,因此P2X7R的功能尚存争议。本文就P2X7R的结构、功能以及在周围神经系统中作用的研究方法做一简单综述,为研究P2X7R在神经再生中的具体功能提供方法学支持。

基于工程化毕赤酵母一锅法合成硫酸软骨素A

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株。通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L。在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了CSA的一锅法生物合成体系。通过优化,最终实现0-40%不同磺酸化水平CSA的可控合成。本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产。本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路。

P2X7R激动剂BzATP对非小细胞肺癌A549细胞生长和凋亡的影响

目的研究配体门控离子通道P2x7受体（P2X7R）在非小细胞肺癌A549细胞中的表达，观察P2X7R激动剂2’-3’-O-（4-苯甲酰-苯甲酰）腺苷三磷酸三乙烷胺盐（BzATP）对A549细胞生长及凋亡的影响，并探究相关作用机制。方法采用免疫荧光法检测P2X7R在A549细胞中的表达。用不同浓度的BzATP（150、300、600μmol／L）处理，未用BzATP干预的细胞作为对照组。采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）和Hoest33342染色法分别检测细胞存活率与凋亡情况，酶联免疫吸附试验检测上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度，Westernblotting检测核转录因子-κB（NF-κB）065,NF-κB抑制因子α（IκBα）及磷酸化NF-KB抑制因子α（phospho-IκBα）蛋白的表达。结果P2X7R在A549细胞膜上表达。在300、600μmol／LB zATP作用下A549细胞存活率分别为（67．87±8．98）％、（44．73±6．92）％，较对照组（98．60±1．44）％明显下降，差异均具有统计学意义（t=4．481，P=0．027；t=3．920，P=0．038）。BzATP可促进细胞凋亡，并且300、600μmol／LBzATP可上调细胞培养上清中TNF-α浓度，分别为（57．35±6．41）pg／ml、（78．63±11．33）pg／ml，与对照组（42．56±0．37）pg／ml比较差异具有统计学意义（t=6．410，P=0．035；t=11．330，P=0．005）。此外，BzATP可下调NF-κB p65的表达，上调IκBα的表达，对phospho-IκBα的表达无明显作用。结论P2X7R表达于A549细胞膜，BzATP能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能与促进细胞中TNF-α的释放，抑制NF-κB通路有关。

重组大肠杆菌高效可溶性表达芳基硫磺基转移酶的研究

3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)是生物肝素酶法制备途径的硫磺基供体,价格高且易分解。芳基硫磺基转移酶(ASTIV,EC 2.8.2.1)可以转化对硝基硫酸苯酯(PNPS)和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)生成PAPS。利用大肠杆菌系统高效可溶性表达ASTIV。对鼠源ASTIV基因序列进行密码子优化并全合成;转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;对表达条件进行优化,提高可溶表达量;Ni2+亲和层析纯化目标蛋白,重组ASTIV产量达到80 mg/L,纯度高达95.3%,比酶活为42.5 m U/mg;用碱性磷酸酶(CIAP)转化ASTIV构型,比酶活进一步提高到85.0 m U/mg。该研究为ASTIV重组表达,PAPS酶法制备以及生物肝素合成奠定了坚实的基础。

植物磺基转移酶研究进展

磺基转移酶(SOT)能催化磺酸基团(SO3-)从通用供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸转移到外源化合物、激素、蛋白质等底物的羟基或氨基上,这一过程被称为磺化。SOT具有高度保守的结构域,广泛存在于真细菌和真核生物中,参与生物体的多种代谢活动,如解毒、激素调节和药物代谢等。在植物中,磺化反应在调节生长发育和适应逆境等方面起着重要作用。本文结合国内外关于SOT的报道,综述了植物SOT的来源、底物特异性、结构和生物学功能,并对植物SOT的功能挖掘及应用前景进行了展望。