FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体,并通过检测荧光素酶活性,初步分析可能调控FOXP3基因表达的miRNAs。方法:利用PCR方法,根据FOXP3基因3’-UTR序列信息设计其扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增FOXP3基因的3’-UTR序列,将其克隆到pmiRB-REPORT双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与FOXP3基因3’-UTR相互作用的miRNAs;利用LipofectaminTM2000试剂将miRNAs mimics与构建好的FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体共转染于常规培养的293T细胞中,然后使用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,并与空白对照相比较。结果:经酶切及基因测序验证,成功构建含有FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体;Targetscan软件预测显示,FOXP3基因3’-UTR可能是miR-608的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-608mimics组比空白对照组[(0.700 0±0.016 41)比(1.000±0.055 75)(P<0.001)]FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降30%。结论:FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,初步证实miR-608对FOXP3有调控作用。