外切核酸酶Ⅲ介导的DNA分子克隆

DNA克隆技术,作为最基本的现代分子生物学实验技术之一,已经成为生物医学研究领域的重要研究手段。传统的分子克隆方法需要经过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接的步骤,是否存在合适的酶切位点和DNA连接酶的效率成为影响克隆的重要限制因素。本文描述了一种由外切核酸酶Ⅲ介导的,以3'-5'外切核酸酶活性和细菌细胞内DNA修复机制为理论基础的DNA分子克隆方法,称为不依赖连接酶的分子克隆(ligation-independent cloning,LIC);证明了该方法的高效性和可靠性,并进一步对酶的用量、反应温度、反应时间、片段载体比例和量等多个参数进行了优化,建立了一种快速、简便和高效的DNA克隆方法。

真核冈崎片段成熟的研究进展

真核冈崎片段的成熟机制比较复杂 ,由Polδ、RNaseHI、FEN1、Dna2和DNA连接酶等多种蛋白质协同通过两种机制加工完成。Polδ的 3′→ 5′核酸外切酶活性能替代FEN1,在冈崎片段成熟中通过阻止过量的DNA链替代合成 ,保证产生能被DNA连接酶连接的具有单一切口两个DNA片段 ,有利于保持基因组的稳定性。