酶催液中3'-唾液酸乳糖分离提纯方法研究

3’-唾液酸乳糖(3’-SL)是一种功能性母乳寡糖,在新生儿的免疫防御、炎症保护、肠道微生态构建中发挥重要作用。近年来,研究者通过构建特定酶系,实现3’-唾液酸乳糖的高产量酶催合成。以酶催反应液为原料,利用膜联用技术和脱色脱盐技术,对酶催液中的3’-唾液酸乳糖进行分离纯化,优化条件及结果如下:90℃热处理后过30nm膜超滤,压力250 kPa,滤洗2次;调定p H10.0后过3 000 Da膜超滤,压力600 kPa,滤洗5次;两步超滤下,蛋白截留率98.7%,目标物回收率87.4%。pH调至中性后过1 000 Da膜纳滤,压力1.9 MPa,滤洗7次,乳糖去除率达到90.7%。活性炭(ZX-305型)添加量1.2%,处理温度55℃,脱色率达到86.3%。离子交换树脂(001×7型和D315型)洗脱速率0.5 BV·h-1,料液3’-唾液酸乳糖浓度10 g·L^(-1),脱盐率达到94.1%,浓缩干燥后样品粉末纯度达到95%~97%(以干物质计)。样品通过液质联用仪、傅里叶红外光谱仪进行结构鉴定,确认为3’-唾液酸乳糖。

多细胞耦合转化N-乙酰氨基葡萄糖和乳糖生产唾液酸乳糖

唾液酸乳糖是母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中含量最丰富的唾液酸化低聚糖之一,对婴幼儿的健康发育有重要作用,但是其目前缺乏高效、廉价的生产工艺。针对该问题,本研究建立了多菌株两步法耦合生物合成唾液酸乳糖方法。第一步构建2株工程菌,大肠杆菌JM109(DE3)/pET28a-BT0453和JM109(DE3)/pET28a-nanA,用于耦合合成中间产物N-乙酰神经氨酸,在2株工程菌株细胞生物量比为1:1,反应时间为32h的条件下,得到的N-乙酰神经氨酸最高产量为20.4g/L。第二步向上述发酵液中添加大肠杆菌JM109(DE3)/pET28a-neuA、JM109(DE3)/pET28a-nst和面包酵母,通过三菌株耦合发酵合成3’-唾液酸乳糖(3’-sialyllactose,3’-SL)。在底物N-乙酰氨基葡萄糖、乳糖浓度均为200mmol/L,面包酵母细胞生物量为150g/L,辅因子Mg^(2+)浓度为20 mmol/L的优化条件下,发酵24 h,发酵液中3’-唾液酸乳糖的最高产量达到55.04 g/L,底物N-乙酰氨基葡萄糖的转化率为43.47%。研究结果为低成本生产3’-唾液酸乳糖提供了一条新的技术路线。

不同母乳低聚糖对肠道LS174T杯状细胞黏蛋白分泌相关基因表达的影响

目的分析不同母乳低聚糖对肠道LS174T杯状细胞黏蛋白分泌相关基因表达的影响。方法以人肠道LS174T细胞为研究对象,将2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)、3’-唾液酸乳糖(3’-sialyllactose,3’-SL)和低聚半乳糖(galactooligosaccharide,GOS)3种低聚糖和乳糖对细胞的作用时间分成24 h组和48 h组,分别在细胞稳态和细胞炎症状态下,以黏蛋白2(mucin 2,MUC2)及其相关基因[三叶因子-3(trefoil factor 3,TFF3)、抵抗素样蛋白B(recombinant resistinlike beta,RETNLB)、碳水化合物磺基转移酶5(carbohydrate sulfotransferase 5,CHST5)、半乳糖-3-O-磺基转移酶2(galactose-3-O-sulfotransferase 2,GAL3ST2)]的表达水平为评价指标,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试验确定影响肠道LS174T杯状细胞黏蛋白分泌相关基因表达的母乳低聚糖。结果在正常状态下,GOS作用后,MUC2及黏蛋白分泌相关基因表达量无显著变化(P>0.05);作用48 h时,3’-SL可显著提高RETNLB基因表达量(P<0.05);在炎症状态下,2’-FL和GOS可极显著促进MUC2、CHST5和TFF3的表达(P<0.01),表明在炎症状态下,2’-FL和GOS可促进杯状细胞分泌黏蛋白。结论在细胞炎症状态下,2’-FL和GOS可提高肠道LS174T杯状细胞黏蛋白分泌相关基因的表达量。