多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

多酶催化合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应体系的构建及优化

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是目前发现的唯一的"活性"硫酸基团供体,在生物肝素酶法硫磺化反应中起到重要作用,但化学合成的成本高。如何大量低成本制备PAPS是实现酶法合成肝素工业化的关键因素。本文克隆表达了酶法合成PAPS的两个酶:三磷酸腺苷(ATP)硫化酶和5’-腺苷磷酰硫酸(APS)激酶。构建了一条体外合成PAPS的途径。首先利用ATP硫化酶将ATP转化生成APS,同时产生副产物无机焦磷酸(PPi),APS再在APS激酶作用下转化生成PAPS。研究了Mg2+浓度、缓冲体系和p H、温度以及无机焦磷酸水解酶(PPase)的添加对该酶反应的影响。通过添加无机焦磷酸水解酶(PPase),极大提高了PAPS的转化率。在最优条件下考察不同ATP浓度下PAPS随时间的积累量变化,发现反应过程中存在底物抑制作用;ATP浓度为50 mmol?L?1时,反应25 h,PAPS的积累量为18.87 mmol?L?1。反应过程中分批补料ATP,能极大提高催化效率。反应11.5 h,PAPS积累量可达20.36 mmol?L?1(10.32 g·L?1),转化率为81.4%。

PAPST1 siRNA抑制髓母细胞瘤细胞系DAOY增殖活性的研究

目的研究3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸转运体1(adenosine-3-phospho-5-phosphosulfate transporter 1,PAPST1)在髓母细胞瘤中的表达情况,探讨其对髓母细胞瘤细胞系增殖活性的影响。方法采用qRT-PCR法检测25例髓母细胞瘤标本、1例原代培养髓母细胞瘤细胞、3例髓母细胞瘤细胞系PAPST1表达,并与正常小脑组织比较,利用免疫组织化学检测PAPST1在髓母细胞瘤中的表达分布,采用PAPST1 siRNA处理髓母细胞瘤细胞系DAOY,利用qRT-PCR、Western blot法检测PAPST1表达变化,CCK-8法检测处理后的DAOY细胞系增殖活性。结果与正常小脑组织相比,PAPST1在18/25(72%)的髓母细胞瘤标本及DAOY、ONS-76细胞系中呈2倍以上的高表达,免疫组化显示PAPST1定位于细胞质中,且染色明显强于正常小脑组织,PAPST1 siRNA在mRNA及蛋白的水平明显干扰了PAPST1的表达(P<0.05),DAOY细胞的增殖活性受到明显抑制(P<0.05)。结论 PAPST1在髓母细胞瘤中有广泛的高表达,下调PAPST1的表达可以降低髓母细胞瘤细胞的增殖活性。

3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸的高效合成及其应用

硫酸化化合物广泛存在于胞浆、细胞表面及胞外基质中,在机体细胞发育、分化、免疫、解毒和信号传递等生命活动过程中起着不可替代的作用。3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(3?-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate,PAPS)是化合物硫酸化过程中最常用的硫酸基供体,但目前合成PAPS并最终实现其工业化应用还困难重重。文中主要综述过去10年内关于PAPS的生物合成及应用的研究进展,以期为PAPS的合成及其在芥子油苷、肝素、硫酸软骨素及羟胺硝喹等的生物合成中的应用提供参考。

新型芳基磺基转移酶在大肠杆菌中的表达及表征

肝素是动物源高度硫酸化、非均一的线性糖胺聚糖。芳基磺基转移酶参与肝素生物合成中磺基供体3′–磷酸腺苷–5′–磷酰硫酸(PAPS)的合成与再生,是实现肝素生理功能的关键酶。目前已报道的芳基磺基转移酶存在种类少、表达量低等问题。本研究采用隐马尔可夫模型挖掘获得10个鸟类来源的磺基转移酶,对新基因进行密码子优化并全合成到表达载体pET-32a上,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21进行诱导表达。通过优化培养基成分、诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及摇床转速,成功实现S4和S8的异源表达。在TB培养基中、诱导温度为16℃、使用0.4 mmol/L IPTG进行诱导、200 r/min转速条件下,菌株BL21/pET32a-Mbp-S4的S4蛋白表达量为60.6 mg/L。对S4蛋白进行纯化和酶活力表征,S4蛋白的最适反应温度为40℃,最适反应pH为7.0,比活力为3.3 mU/mg。通过超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)检测酶修饰后产物,进一步验证S4蛋白为芳基磺基转移酶。芳基磺基转移酶S4的成功表达为PAPS再生提供了功能元件。

硫苷生物合成过程中硫来源的研究进展

硫苷是十字花科Cruciferae植物中一类富含氮硫的次生代谢物,硫苷合成途径,特别是硫与硫苷合成关系的研究取得了很多进展。从硫苷核心结构形成过程中还原硫供体来源、活化硫酸盐来源以及半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和高能硫供体3′磷酸腺苷5′磷酰硫酸(PAPS)等初生硫代谢产物与硫苷合成间的关系等方面对硫苷合成过程中硫来源的研究进展进行了综述,提出GSH等初生硫代谢调控因子、氮硫等营养元素之间的平衡以及葡萄糖等信号分子对硫苷生物合成的调控机制将成为新的研究热点,以期为硫苷的生物合成调控研究提供理论依据。

基于工程化毕赤酵母一锅法合成硫酸软骨素A

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株。通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L。在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了CSA的一锅法生物合成体系。通过优化,最终实现0-40%不同磺酸化水平CSA的可控合成。本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产。本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路。

重组大肠杆菌高效可溶性表达芳基硫磺基转移酶的研究

3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)是生物肝素酶法制备途径的硫磺基供体,价格高且易分解。芳基硫磺基转移酶(ASTIV,EC 2.8.2.1)可以转化对硝基硫酸苯酯(PNPS)和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)生成PAPS。利用大肠杆菌系统高效可溶性表达ASTIV。对鼠源ASTIV基因序列进行密码子优化并全合成;转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;对表达条件进行优化,提高可溶表达量;Ni2+亲和层析纯化目标蛋白,重组ASTIV产量达到80 mg/L,纯度高达95.3%,比酶活为42.5 m U/mg;用碱性磷酸酶(CIAP)转化ASTIV构型,比酶活进一步提高到85.0 m U/mg。该研究为ASTIV重组表达,PAPS酶法制备以及生物肝素合成奠定了坚实的基础。

植物磺基转移酶研究进展

磺基转移酶(SOT)能催化磺酸基团(SO3-)从通用供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸转移到外源化合物、激素、蛋白质等底物的羟基或氨基上,这一过程被称为磺化。SOT具有高度保守的结构域,广泛存在于真细菌和真核生物中,参与生物体的多种代谢活动,如解毒、激素调节和药物代谢等。在植物中,磺化反应在调节生长发育和适应逆境等方面起着重要作用。本文结合国内外关于SOT的报道,综述了植物SOT的来源、底物特异性、结构和生物学功能,并对植物SOT的功能挖掘及应用前景进行了展望。