犬冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立犬冠状病毒(CCoV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验通过分析比对NCBI下载的犬冠状病毒(CCoV)全基因组序列,在其3′UTR保守区设计一对特异性引物及TaqMan探针,经反应条件优化,建立CCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用建立的检测方法检测CCoV标准品,绘制标准曲线,检测建立方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测,且与普通RT-PCR检测结果进行比较,计算符合率。结果表明:标准曲线方程为y=3.25x+10.84,相关系数为0.996 4,在2.61×10^(1)~2.61×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。除CCoV检测结果为阳性外,犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬副流感病毒检测结果均为阴性;检测下限为2.61×10^(1)拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%。建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检出阳性临床样品9份,而普通RT-PCR检出阳性临床样品5份,两种检测方法的符合率为91.66%。说明建立的CCoV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于犬冠状病毒病的临床检测。