一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA3′末端序列(英文)

根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端。与常规的 3′RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA植物双价表达载体的构建及转化番茄的研究

将烟草中经修饰的Ⅰ类几了质酶和β－1，3-葡聚糖酶cDNA分别加上CaMV35S启动子和NOS终止子，依次插入到同一植物表达载体pBin19上，获得植物双价表达载体pCG－Ⅱ。然后载体pCG－Ⅱ以土壤农杆菌LBA4404介导转化番茄，再生植株的点杂交及PCR扩增证明两种cDNA已随T－DNA同时导入番茄植株中。

两步PCR快速扩增东亚钳蝎BmKIT3 3'cDNA末端序列

对3′RACE方法进行了修改,采用一条特异性引物和一条通用OligodT引物成功地克隆了东亚钳蝎BmKIT33′cDNA末端,与常规3′RACE方法相比,两步PCR方法具有节约成本、节省时间、增加反应特异性等优点,尤其适用于生物活性肽基因的快速克隆和鉴定.

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

草原兔尾鼠卵透明带3(ZP3)cDNA保守序列的克隆与序列分析

根据 Gene Bank数据库中 5种啮齿目动物卵透明带 3 (ZP3 ) c DNA的序列 ,利用 DNAMAN和 NIH NCBI BLAST同源性分析程序设计了特异性引物。从 6周龄的未孕雌性的草原兔尾鼠卵巢中用柱离心法得到总 RNA,利用反转录技术得到 c DNA,通过特异性引物进行 PCR扩增草原兔尾鼠的 ZP3 c DNA保守序列。将扩增产物连接到 p MD1 8- T载体上 ,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆 ,酶切鉴定后进行测序。将其与 Gene Bank中啮齿目动物 ZP3 c DNA进行同源性比较 ,获得了草原兔尾鼠 ZP3 c DNA的保守基因序列 ,与啮齿类同类基因比较 ,具有较高的同源性。

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3＇-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ（Oglc13Ⅱ）3＇末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦（Avena Sativa）幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片 段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3＇sites Adaptor Primer作为下游引物,按3＇RACE试剂盒（Takara）操作流程进行Oglc13Ⅱ3＇末端cDN A的快速扩增,成功获取837bp的3＇-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与 许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性（50.0%～72.0%）.因此认为成功 克隆了Oglc13ⅡcDNA的3＇末端序列.

高等植物F3′HcDNA及其氨基酸序列的生物信息学分析

用生物信息学方法对GenBank中拟南芥、油菜、大豆、矮牵牛和高梁等的类黄酮3′-羟化酶基因的cD-NA序列及其编码氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域、功能域和进化关系进行了初步预测和分析。结果表明:不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列的相似性为69.5%,其起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA、TAG或TGA,包括5,′3′非翻译区和一个开放阅读框;不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列编码的氨基酸序列的理化性质基本一致,相似性为72.5%,含有6段保守氨基酸序列,是"PPGR"、"AGTDT"、"RPPN"、"AYNY"、"IKALLL"、"TPLS";在进化关系上可划分为两大类;不同植物类黄酮3′-羟化酶具有一个跨膜结构域、定位于内质网上,并有一段与细胞色素P450功能区相匹配的功能域;类黄酮3′-羟化酶属具转运肽的亲水性稳定分泌蛋白,其二级结构为α-β型,α-螺旋和无规卷曲为最主要的结构元件,延伸链和β-转角散布于整个结构。可为类黄酮3′-羟化酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。

蒙古冰草磷脂酶D基因cDNA3’端的克隆及分析

目的:采用3’RACE方法对蒙古冰草磷脂酶D(PLD)基因3’端全序列进行了快速扩增和序列分析,为得到全序列及研究该基因的功能奠定基础。方法:实验以蒙古冰草幼叶为材料,利用RT-PCR技术得到PLD基因的部分cDNA序列,根据此序列设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即M13PrimerM4作为下游引物,按3’RACE试剂盒(TaKaRa)操作流程进行PLD基因3’末端的快速扩增,成功获得993bp的3’RACE反应产物,采用DNAStar软件对扩增的PLD基因的3’RACE产物和中间片段进行拼接,最终获得2113bp的PLD基因3’端cDNA序列。结果:通过BLAST技术,发现该片段与许多植物磷脂酶D基因的同源性为47.0%～80.0%。结论:通过同源性比较,成功克隆了PLD基因cDNA3’端序列。

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。

不同抗冷性水稻中编码甘油-3-磷酸转酰酶的部分cDNA的序列比较研究

采用RT -PCR技术 ,以根据国外报道的几种双子叶植物的甘油 - 3-磷酸转酰酶的相对保守的氨基酸序列而设计的简并引物作为扩增引物 ,从不同抗冷性水稻品种中均扩增到一段约 315bp的cDNA片段。测序结果表明它们都是编码GPAT的部分cDNA ,含有 315个核苷酸 ,编码 10 5个氨基酸。比较它们之间的核苷酸及推导氨基酸序列 ,发现有一定差异 ,且抗冷性相差越大的品种间差异越大。抗冷性的差异可能与脯氨酸的替换有关。

苎麻CCoAOMT基因cDNA反义转化模式烟草‘WS38’

苎麻咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)是其木质素合成过程的一种关键酶,运用克隆的该酶基因cDNA及植物表达载体pBI121、pWM101,分别构建了35S启动子控制的苎麻CCoAOMT基因反义cDNA基因质粒(pBI121-antiBnCCoAOMT)和cDNA全长表达质粒(pWM101-BnCCoAOMT),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因植株进行分子分析和组织学初步研究表明,转反义RNA基因植株叶柄木质素含量较野生烟草或转正义基因烟草叶柄木质素含量降低.说明运用反义RNA技术对CCoAOMT基因的表达进行基因工程调控,一定程度上可以对木质素的合成产生干扰,为获得低木质素或木质素组分改良的苎麻基因工程奠定基础.

3′端非翻译区影响TNFα cDNA在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法改变了表达构建物pRL-rhTNF中的结构,即去掉rhTNFαcDNA3＇端非翻译区序列110bp(命名为pRL-rhTNFα2),转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL-rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3＇端非翻译区的pRL-rhTNFα2能稳定表达rhTNFα,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高,提示3＇端非翻译区序列对表达有影响。3＇端非翻译区内存在一个相似于TA的重复序列——TTTA TTA七聚体。这可能是本研究中影响TNFα表达量的原因之一。

条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析(英文)

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域合成探针,并对条斑紫菜cDNA文库进行筛选,获得了一个编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)的全长cDNA克隆(GAP4)。GAP4包含了全长的叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列,编码72个氨基酸的信号肽和338个氨基酸的成熟蛋白。将获得的GapA蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后,发现条斑紫菜的GapA氨基酸序列都包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GapA的cDNA序列中GC含量很高(64.2％),与紫菜EST分析中得到的结果(65.2％)近似。通过GAPDH的分子系统发育分析,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库,序列号为:AY273819。

异育银鲫Toll样受体3的cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫Toll样受体3(cagTLR3)基因全长cDNA序列。该cDNA全长3170bp,5′端非编码区181bp;3′端非编码区283bp;开放阅读框(ORF)2706bp,编码901个氨基酸。经序列同源性分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼、斑马鱼、斑点叉尾、虹鳟和红鳍东方有较高的相似性,其相似性分别为92%、88%、79%、75%和72%,说明TLR3在长期的进化中具有较高保守性。TLR3全长序列起始21个氨基酸残基为信号肽;50至695个氨基酸残基间包含15个富含亮氨酸的重复序列(LRR);704至726个氨基酸残基为跨膜区(TM);754至897个氨基酸残基为与白介素-1受体高度同源的区域(TIR)。将异育银鲫TLR3与人和斑马鱼胞内TIR结构的氨基酸比对后发现,Phe728、Leu738、Tyr756与Arg736在TLR3的信号转导及胞内定位过程中起到关键作用。异育银鲫TLR3胞外配体结合域的三维结构呈U型,与人TLR3的相应结构十分相似,在N端具有1个二硫键,C端有2个。因LRRs上的插入序列和14个糖基化位点,异育银鲫TLR3胞外配体结合域内表面的大量β-折叠结构呈平坦的平面。

猪CD3∈分子的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR和3′RACE技术,本研究从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪CD3ε基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,猪CD3εcDNA序列长1241nt,其中5′非翻译区80nt,3′非翻译区570nt,开放阅读框591nt,该开放阅读框编码196个氨基酸残基的CD3ε前体蛋白(无糖基化位点);在猪CD3ε蛋白的胞外区,Cys49、Cys91、Cys108和Cys111为保守性氨基酸残基,它们与CD3ε免疫球蛋白样结构的形成有关。在猪CD3ε蛋白胞浆区,存在免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、内质网潴留基序和1个SH3结合基序,其中ITAM基序含有2个SH2结合基序和2个潜在酪氨酸磷酸化位点Tyr177和Tyr188,这些基序是猪CD3分子参与T细胞活化信号转导和TCR-CD3复合体装配的结构基础。推导氨基酸序列分析结果表明,猪与人、鼠、狗、牛和绵羊CD3ε蛋白的氨基酸同源性分别为61.2%、58.7%、58.7%、65.1%和65.6%。

灰飞虱β3-微管蛋白cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱RNA,利用RT-PCR技术,克隆了灰飞虱体内β3-微管蛋白基因部分序列。进一步通过3'-和5'-RACE获得了全长。序列分析表明,该基因(LSTUB3)长1859bp,编码的蛋白含454个氨基酸,分子量约为51kDa;类似于其他昆虫的β-微管蛋白,LSTUB3含有2个氨基酸保守区:NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF。另外,LSTUB3还具有1个由6个氨基酸组成的β3-微管蛋白特征性的插入序列:CASRGG。结合已发表的其他昆虫该基因的序列,构建了分子系统树,系统分析表明:LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性,达85.7%以上。

IL-2Rα链cDNA3’端系列缺失克隆的构建

运用Bal 31末端缺失技术将人IL-2Rα cDNA进行3’—5’的单向缺失,获得了IL-2RαcDNA3’端的系列缺失子。经DNA顺序分析表明:这些缺失克隆分别含有不同位置上的Poly(A)信号序列,将它们克隆到穿梭质粒P^(91023)上,得到了系列缺失子的表达性质粒P^(91-IL2R),为进一步分析Poly(A)及3’非转译区(3’UTR)对IL-2Rα基因转译调控的影响创造了必要条件。

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析。方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段。PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对。结果:克隆获得531bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBankAN:AY965896)。同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%。结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段。

酵母tRNA结合蛋白(43kD蛋白)羧端cDNA的克隆及其序列测定

为了研究酵母分子量为 4 3kD的tRNA结合蛋白的基因来源 ,通过溴化氰部分化学裂解此蛋白 ,产生的 18kD肽段经过蛋白质氨端序列测定 ,测得 18kD肽段氨端部分序列为AFTFKK .针对序列AFTFKK设计简并引物 ,利用简并PCR方法和cDNA的 3′末端的快速扩增方法 (3′RACE) ,成功克隆 4 3kD蛋白mRNA的 3′端序列 .DNA序列测定结果表明 ,该序列位于 3 磷酸甘油酸激酶 (PGK1)基因 10 0 3位— 170 0位 ,长度为 6 98bp ,编码 3 磷酸甘油酸激酶羧基端的 180氨基酸残基以及 3′端非翻译区 .结果证实 ,4

人IL—3cDNA探针制备及应用

采用多聚酶连反应（ＰＣＲ）扩增人ＩＬ—３ｃＤＮＡ片段，以地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ—１１—ｄＵＴＰ）为标记物，随机引物法标记ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针检测细胞ＩＬ－－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强，灵敏度高，使用简便，杂交结果直观，探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。