产1，3丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.

LLE-GC-MS法同时测定甘磷酸胆碱中的缩水甘油和3-氯-1,2-丙二醇

目的 建立液液萃取-气相色谱-质谱法(LLE-GC-MS)同时测定甘磷酸胆碱原料药中的基因毒性杂质缩水甘油和3-氯-1,2-丙二醇。方法 采用酸性氯化钠溶液和酸性无水硫酸钠溶液分别处理甘磷酸胆碱原料药,经硅藻土柱净化、富集后用七氟丁酰基咪唑衍生,采用气相色谱-质谱法(SIM模式)进行检测,以D5-3-氯-1,2丙二醇作为内标,通过双样本差减法计算样品中缩水甘油和3-氯-1,2-丙二醇的含量。结果 2种基因毒性杂质与内标物的峰面积比值在0.1~2 mg·L^(-1)浓度范围内呈线性相关,相关系数(r)均不小于0.999 2,样品的加样回收率为86.4%~103.3%(RSD<6.0%,n=9)。结论 该方法灵敏度高、专属性强,适用于甘磷酸胆碱原料药中缩水甘油和3-氯-1,2-丙二醇的测定。

SPE-GC-MS法测定固态调味品中3-氯-1,2-丙二醇

目的:建立了固相萃取-气相色谱-质谱法测定固态调味品中的3-氯-1,2-丙二醇的检测方法。方法:样品经乙醚提取,经SPE柱净化,用七氟丁酰基咪唑作为衍生化试剂,采用非极性毛细管色谱柱DB-5MS分离,GC-MS选择离子监测模式(SIM)测定,同位素内标定量。结果:3-氯-1,2-丙二醇线性范围为0.001~1.0 mg/kg,相关系数r为0.9998,相对标准偏差RSD为0.4~9.2%,检测下限为0.001 mg/kg,4种不同类型样品的加标回收率为81.0~104%。对鸡精、味精、鸡粉、香辛料粉、猪骨高汤粉、方便面调味料、其他调味料等7类,共30批固态调味品,进行3-氯-1,2-丙二醇含量的检测,发现复合香辛料中没有检出3-氯-1,2-丙二醇,而其他调味料中均有3-氯-1,2-丙二醇检出,含量在3.92~856 μg/kg。结论:该方法减少了有机溶剂的消耗,节省了前处理的时间,且灵敏度高,结果准确,适合批量测试,能满足日常固态调味品中3-氯-1,2-丙二醇的检测。

气相色谱—质谱法快速测定乳粉中2种单氯丙二醇

本文研究建立一种适用于乳粉中3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)和2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)的气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测方法。样品经甲醇提取浓缩后,加入20%氯化钠溶液复溶,正己烷脱脂后无需进一步净化,通过乙酸乙酯萃取,并加入苯基硼酸作为衍生化试剂,浓缩后采用DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)分离,选择离子监测模式(SIM)下测定,内标法定量。结果表明,该方法在0~400μg/L范围内线性良好,相关系数(r^(2))均大于0.999;方法检出限(LODs)均为0.002 mg/kg,定量限(LOQs)均为0.005 mg/kg;在定量限、3-MCPD限量值及介于二者之间的3个浓度水平的平均回收率为96.3%~103.8%,相对标准偏差(RSD)为0.19%~8.36%。该方法操作简便、成本较低,且灵敏度好,准确性高,可为乳粉的风险监控提供技术支持。

Pt/WO_3/ZrO_2催化甘油选择性脱羟基制1,3-丙二醇反应的溶剂效应

考察了不同溶剂中Pt/WO3/ZrO2催化剂催化甘油加氢制1,3-丙二醇的反应性能.结果表明,质子溶剂乙醇和水有利于甘油转化为1,3-丙二醇.含有乙醇或水的二元混合溶剂表现出明显的溶剂组分协同效应,使用混合溶剂时1,3-丙二醇选择性超过使用单一溶剂,而且混合溶剂的组成对反应性能影响很大.

高效液相色谱法测定1,3-丙二醇发酵液中的有机酸

采用高效液相色谱法在Kromasil C18色谱柱（5μm，250mm×4．6mm i．d．）上测定了1，3-丙二醇发酵液中的有机酸，流动相为0．2％（V/V）磷酸和乙睛混合溶液（体积比为96．5：3．5），发酵液经氯仿处理后直接分离定量，8min内可将发酵液中的甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸及延胡索酸完全分离定量。流动相流速为1．0mL／min，紫外检洲波长为214nm，柱温为20℃。方法的回收率为97．7％～100．5％；RSD为0．98％～2．35％。实验结果表明，该法是测定发酵液中有机酸的快速、有效的定量分析方法。

产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建

以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coliJM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将甘油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的构建及其转化甘油

利用温控载体pHsh将编码甘油脱水酶的基因dhaB和编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD串联构建重组质粒pHsh-dhaB-yqhD,将其转化大肠杆菌得到新型产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD),并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.实验结果表明:该重组菌转化甘油合成1,3-丙二醇的适宜培养基组成为甘油60g·L-1、酵母膏5·0g·L-1、维生素B120·05g·L-1以及KH2PO47·5g·L-1;以此培养基在5L发酵罐上进行放大,1,3-丙二醇产量、转化率和生产能力分别达到43·26g·L-1、72·2%和1·55g·L-1·h-1.

琥珀酸对产酸克雷伯氏菌好氧发酵甘油产1，3-丙二醇的影响

好氧条件下,通过产酸克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的摇瓶实验中发现,添加副产物琥珀酸对菌体生长和1,3-丙二醇合成有促进作用,在5L自动发酵罐上做批式发酵,也得到相似的结果。为探讨其原因,进行了类似的摇瓶实验,分别添加副产物乳酸和乙酸,菌体生长和1,3-丙二醇合成均受到抑制,添加琥珀酸、柠檬酸和苹果酸,对菌体生长和1,3-丙二醇合成均有促进作用。上述结果初步表明,琥珀酸强化了三羧酸循环产生更多的能量,促进了甘油脱水酶的复活,引起1,3-丙二醇产量的增加。

途径工程生产1,3-丙二醇的研究进展

利用基因工程技术生产1,3-丙二醇,特别是途径工程的利用已取得了重大突破.利用生物技术生产1,3-丙二醇的成本比化学法的低25%,它将逐步实现工业化生产.介绍了一步法生产1,3-丙二醇的超级基因工程菌所需的3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)、甘油3-磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶(dhaB)和1,3-丙二醇氧化还原酶(dhaT),并对关键酶dhaB进行了分析,同时介绍了穿梭质粒和甘油-3-磷酸酶积累对生产的影响.最后,对今后的研究重点和策略进行了探讨.

油脂中3-氯丙二醇酯形成的化学反应机制

3-氯丙二醇酯是油脂及油脂食品在热加工过程中生成的副产物,目前被认为是潜在的食品安全危害因子之一。本文介绍了油脂中3-氯丙二醇酯形成的3种化学反应机制,普遍认为是氯离子的亲核进攻导致了3-氯丙二醇酯的形成。其中,第1种机制认为氯离子亲核反应的中间体环酰氧鎓离子是3-氯丙二醇酯的前体;第2种机制认为是亲核的氯离子直接攻击甘油骨架上的酯基或质子化羟基;第3种机制认为缩水甘油酯可能作为氯离子亲核反应的中间体而成为其前体。

甘油与氯化钠模型热反应中生成3-氯-1，2-丙二醇的研究

以甘油、氯化钠、水为原料建立热反应模型,结合气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析,对其生成的3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)进行了研究。通过正交实验,考察了反应时间、温度和各原料用量对3-MCPD生成量的影响,同时研究了在热反应模型中分别加入不同种类单糖和氨基酸后3-MCPD生成量的变化规律,并对其反应机理进行了探讨。结果表明,反应时间2h、反应温度140℃、甘油用量0.05g(占原料总量0.31%)、NaCl用量1.0g(6.23%)、水用量15g(93.46%),3-MCPD生成量最少;葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸使3-MCPD的生成量减少;谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸使3-MCPD的生成量增加;半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸对3-MCPD的生成无明显作用。

甘油歧化为1,3-丙二醇的代谢及关键酶研究进展

微生物发酵生产1,3-丙二醇因对环境友好而成为研究热点。通过对发酵菌种、代谢途径、调节子和关键酶的分析,阐述了微生物转化甘油为1,3-丙二醇的分子机理。尤其对还原途径的限速酶-甘油脱水酶的分子结构及再激活因子进行了详细分析,为菌种的遗传改造提供了理论依据。

1,3-丙二醇发酵中甘油代谢及产物抑制作用

对微生物法甘油转化成1,3-丙二醇过程中代谢规律及代谢控制的相关酶作以简述,并着重分析了丁酸梭菌发酵生产中乙酸、丁酸等副产物对细胞的抑制作用,对未来的研究发展方向进行了展望。

吸附树脂在酶法制备1,3-丙二醇中的应用

筛选出了对辅酶NAD、酶蛋白弱吸附(吸附率分别为10%,9%),对产物1,3-丙二醇(1,3-PD)与二羟基丙酮(DHA)强吸附(吸附率分别为30.5%,34.5%)的吸附树脂SIPI-40,并进行产物的吸附分离,达到酶与辅酶回流利用、反应连续进行的目的,并应用于伴有辅酶NADH再生的酶法催化甘油(Gly)制备1,3-PD的新型反应体系的构建;经单因素考察,确定较佳操作条件是:树脂质量与底产物浓度数值比大于1.4:1,吸附时间为2h;在此条件下进行反应操作,测得每批次反应中1,3-PD相对于甘油的产率稳定在20%左右(分别为22.5%,20.6%与19.3%);在连续催化反应中,1,3-PD总产率达45.3%。实验结果说明,吸附树脂分离产物可应用于1,3-PD酶法连续反应体系的构建。该研究工作的新颖性,已为厦门市科学技术情报研究所2006年12月11日出具的第2006581号《科技查新报告》所证实。

利用PDOR同工酶基因yqhD对产1,3-丙二醇克雷伯氏杆菌进行基因工程改造

由于Klebsiella pneumoniae1,3-丙二醇合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-丙二醇合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae1,3-丙二醇合成途径,利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出以NADPH为辅酶的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出2.66kb的甘油脱水酶基因(dhaB),构建了产1,3-丙二醇关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,重组载体得到了表达。通过初步发酵,重组后的克雷伯氏杆菌产量比原始菌高20%左右,副产物中乙酸和丁二醇分别下降30%左右。

1,3-丙二醇生产的研究进展

作为一种重要的化工材料,1,3-丙二醇凭借其自身的优点,在工业生产中具有很高的应用价值。但其传统的生产方法,操作繁琐、技术难度大、设备投资高,已无法满足对1,3-丙二醇的日益增长的需要;而微生物发酵法又面临着产率低、发酵条件难以控制等弊病。相反,基因工程技术在1,3-丙二醇生产过程中扮演着越来越重要的角色。简要综述了1,3-丙二醇研究及生产工艺的进展。

新型可降解丁二酸-1,4-丁二醇-1,3-丙二醇-尿素共聚物的合成与表征

以丁二酸、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇和尿素为原料，采用熔融缩聚法制备低分子量的聚酯酰胺预聚体，以甲苯二异氰酸酯（TDI）作为扩链剂对聚酯酰胺预聚体进行扩链，得到了一系列M。为1.O×1O^5～1．7×1O^5的新型可降解丁二酸-1，4-丁二醇-1，3丙二醇-尿素共聚物（聚酯酰胺），并采用流延法制备了聚酯酰胺薄膜。考察了尿素含量对聚酯酰胺热性能、结晶性能、力学性能和降解性能的影响。采用FT-IR、1^HNMR、GPC、TG、DSC和XRD等对聚酯酰胺进行了表征。结果表明，随着尿素含量的增加，聚酯酰胺的熔点和热稳定性下降。尿素的加入未改变聚酯酰胺中聚酯相的晶型，但破坏了聚酯链段的规整性，使其结晶度降低。随着尿素的加入，聚酯酰胺薄膜的力学性能和降解性能不断提高。

微生物转化法生产1,3-丙二醇的研究进展

综述微生物转化法生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的研究进展,包括发酵菌种和发酵工艺等.生物转化法生产1,3-PD与化学法相比,具有选择性好、转化率高、分离纯化简单、无污染、利用可再生资源等优点.要使生物转化法生产1,3-PD能与化学法竞争,在提高1,3-PD发酵生产水平的同时,必须有效降低生产成本.以生物柴油副产物废甘油为发酵底物生产1,3-PD,可大大降低1,3-PD生产成本,同时解决废甘油高附加值利用的问题,延长产业链.但存在的问题是废甘油成分复杂,抑制了微生物的生长和代谢.

无催化剂条件下聚(癸二酸-1,3-丙二醇)酯的合成及其分子质量研究

在无催化剂条件下,采用直接熔融缩聚的方法合成了聚(癸二酸-1,3-丙二醇)酯,并通过凝胶渗透色谱(GPC)测其分子质量,同时考察了单体摩尔比及反应时间对产物组成及分子质量的影响。结果表明,反应体系中丙二醇用量越多时,体系中生成不同分子质量产物的多组分现象就越明显,产物的分子质量也较小;而反应体系中丙二醇用量较少时,则有利于产物的均一化,产物的分子质量也较大。此外,反应时间的延长有利于增大产物的分子质量,也增加高分子质量组分在产物中的含量。