广西巴马小型猪α-1，3半乳糖转移酶基因真核表达载体的构建及鉴定

目的通过RT-PCR扩增巴马小型猪GGTA1基因，分析其序列的结构特点并构建真核表达载体。为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础。方法根据NCBI上发布的猪α-1，3半乳糖转移酶基因cDNA序列（AF221508），设计合成一对含有HindⅢ和BamHI酶切位点的特异性引物，以广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板进行RT-PCR，所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序；将目的基因与pEGFP-N1进行双酶切后连接构建真核表达载体pEGFP-GGTA1，通过测序，双酶切鉴定。结果所克隆的广西巴马小型猪GGTA1基因存在缺失第五外显子（81．116）的GGTA1序列。序列全长1080bp和未缺失第五外显子的GGTA1序列，全序列为1116bp。构建两个表达载体（缺失第五外显子pEGFP．GGTA1-1、未缺失第五外显子pEGFP-GGTA1-2）。结论广西巴马小型猪GGTA1基因存在第五外显子缺失的现象，通过对GGTA1基因克隆序列进行分析以及构建两个真核表达载体，为后面在猪源PK-15细胞中对其进行表达鉴定以及巴马小型猪α-1,3半乳糖转移酶基因的沉默实验奠定基础。

异源基因α1,3半乳糖转移酶与增强型绿色荧光蛋白融合对荧光蛋白表达的影响

目的研究异源(猪)基因α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因形成的融合蛋白对其荧光表达量的影响。方法 BamHI,EcoRI酶切pcDNA3.1-α1,3GT重组载体后,回收含α1,3GT的片段,与BamHI、EcoRI酶切回收的pEGFP-N1载体连接,并酶切、测序鉴定重组真核表达载体pEGFP/α1,3GT。将该表达载体转染人肺癌细胞A549、人胚肾细胞293FT,EGFP的表达用荧光显微镜观察和流式细胞仪进行荧光定量分析。结果 pEGFP-N1载体转染A549和293FT后48h的转染阳性率分别80.5﹪和86.5﹪;pEGFP/α1,3GT载体转染A549和293FT细胞后48h的转染效率则为75.8﹪和81.2﹪。A549细胞空白对照,转染pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT载体的A549细胞平均荧光强度分别为1.21、0.956;293FT细胞空白对照,pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT载体的293FT细胞平均荧光表达量分别为7.66、1.00。结论 pEGFP/α1,3GT融合蛋白的生成抑制了绿色荧光蛋白的表达强度。

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2与肿瘤转移关系的研究

半乳糖-3-O-磺酰基转移酶-2(GP3ST)是一个新近克隆的磺酰基转移酶,其生物学功能还不明确.GP3ST在肿瘤细胞和肿瘤组织中差异性表达,以及催化所形成的磺酰化糖链与肿瘤转移潜能密切相关,是首次研究报道.在高转移潜能的肿瘤细胞中,GP3ST及其产物的表达明显高于低转移潜能的细胞,在伴有淋巴结转移的喉癌组织中,GP3ST的高表达率也明显高于无淋巴结转移的喉癌组织(P<0.05),而且在喉癌组织中的表达也明显高于相对应的癌周组织.利用RNAi技术下调肝癌细胞SMMC7721中GP3ST的表达,观察到稳定转染RNAi/GP3ST的细胞形态发生明显的改变,由多边形转变为近似梭形,与TNF-α刺激后的HUVEC和sL-选凝蛋白的黏附能力下降.进一步研究表明,GP3ST表达的下降能抑制细胞中的整合蛋白αV亚基的表达,而β3亚基表达无改变,同时在高转移细胞株中αV的表达也明显高于低转移细胞株,与GP3ST表达的差异性相一致.上述结果充分说明GP3ST催化合成的糖链可通过调节肿瘤细胞的黏附性和影响整合蛋白αV亚基的表达参与肿瘤转移.

UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖氨基转移酶3:一个新的磷调节蛋白的调磷机制

UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖氨基转移酶3(ppGalNacT3)是催化成纤维细胞生长因子23(FGF23)O-糖基化的起始酶,其编码基因GALNT3的突变可以导致以高磷酸盐血症及软组织钙化为特征的高磷酸盐血症型家族性肿瘤样钙化(HFTC)。磷是人体重要的矿物质,参与包括骨骼矿化在内的许多重要生理过程,磷代谢紊乱可以导致骨骼矿化障碍,引起骨软化、骨质疏松等代谢性骨病的发生。磷稳态的调节对骨骼健康有非常重要作用。本文就一个新近发现的磷调节相关蛋白ppGalNacT3的结构和功能进行综述,并试阐述其调节血磷的机制以及对骨骼矿化的影响。

广西巴马小型猪α-1,3-半乳糖转移酶基因RNAi载体构建与检测

α-1,3-半乳糖转移酶基因(α-1,3 GT)在异种器官移植中的免疫排斥反应有重要的作用,本研究旨在构建α-1,3-半乳糖转移酶基因的干扰载体,在m RNA和蛋白质水平鉴定并筛选出干扰效果最佳的序列。根据巴马小型猪GGTA1基因CDS序列,设计合成3对特异性单链si RNA序列以及一对阴性序列,构建GGTA1 RNA干扰载体分别命名为p LLU2G-sh GGTA1-1、p LLU2G-sh GGTA1-2、p LLU2G-sh GGTA1-3和p LLU2G-sh GGTA1-NC。将构建好的载体分别转染转染PK15细胞,通过q RT-PCR和Western blot检测GGTA1 m RNA及其蛋白的相对表达量。结果显示本研究成功构建了3个重组RNAi表达载体,与转染p LLU2G-NC和空白组相比,p LLU2G-sh GGTA1-1、p LLU2G-sh GGTA1-2和p LLU2G-sh GGTA1-3转染组的GGTA1 m RNA和蛋白表达量均明显下降,对m RNA表达的抑制效率分别为85.02%、86.05%和83.85%。本研究成功获得有效抑制广西巴马小型猪GGTA1基因表达的RNAi载体,为下一步生产沉默GGTA1基因广西巴马小型猪奠定基础。

α1,3-半乳糖转移酶及其相关糖基转移酶的研究进展

糖基化作用是最重要的翻译后修饰之一。多种多样的半乳糖化反应使得生物体可以表达极其多样的寡糖结构。α1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)、ABO血型抗原合成酶及异红细胞糖苷酯合成酶(iGb3 s)均催化半乳糖在α1,3糖苷键之间的转移。前两者合成的抗原在异种移植(Galα1,3-Gal抗原,简称αGal)和同种异基因移植(ABO抗原)的免疫排斥反应中发挥重要的作用。本综述主要讨论这些转移酶的特性、其合成的抗原及其在移植中的意义。

N-乙酰半乳糖胺转移酶-3预测周围型小肺腺癌预后

目的 探讨周围型小肺腺癌（癌瘤直径＜2cm）中N-乙酰半乳糖胺转移酶-3（GalNAc-T3）的表达及其预后影响因素.方法 分析2006年1月至2009年6月手术证实周围型小肺腺癌患者共计108例,随访资料完整.术后对病灶组织切片采用针对GalNAc-T3免疫组织化学（IHC）染色评估标本中GalNAc-T3表达水平,分析患者临床特征及其对预后的影响.结果 GalNAc-T3低表达率为40.7％,其表达水平与组织分化程度（P＜0.05）、胸膜侵犯（P＜0.05）、淋巴转移（P=0.05）、血行转移（P＜0.01）和Noguchi病理组织分型（P＜0.05）有关,但与性别、年龄、TNM分期及血清癌胚抗原（CEA）浓度无相关（P＞0.05）.单因素分析表明Noguchi病理组织分型（x2=4.845,P＜0.05）、胸膜侵袭（x2=15.975,P＜0.01）及GalNAc-T3表达（x2=8.830,P＜0.01）是影响周围型小肺腺癌患者预后相关因素,多因素分析表明胸膜侵犯[相对危险度（RR）=0.187,95％可信区间（CI）：0.063-0.550]与低表达GalNAc-T3（RR=4.030,95％ CI：1.284 - 12.647）是影响患者预后的独立危险因素（P＜0.05）.结论 在周围型小肺腺癌中低表达GalNAc-T3与组织分化程度、胸膜侵犯、淋巴转移、血行转移和Noguchi病理组织分型相关,并可作为影响患者预后的预测指标.

GALNT3作为潜在肿瘤分子标志物及药物靶点的研究进展

黏蛋白型O-糖基化是蛋白质中最常见的翻译后修饰之一,可以改变蛋白质的空间构象与生物学功能,在细胞信号转导、细胞黏附、免疫应答等生物学过程中发挥着关键作用。而多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶3(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase3,GALNT3)作为黏蛋白型O-糖基化的起始酶,在维持人类细胞和组织的稳态中具有重要意义,而其功能失调已被发现在钙磷代谢紊乱、动脉粥样硬化等多种疾病中发挥作用。此外,GALNT3被发现在结直肠癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中异常表达,且与患者的临床病理特征和较差预后相关,可以作为肿瘤早期诊断和预后评估的潜在标志物。进一步研究表明,GALNT3既可通过调控糖基化水平,降低肿瘤细胞之间的黏附水平,也可通过激活多条代谢相关通路,促进肿瘤细胞的侵袭转移。该文就GALNT3在恶性肿瘤发生发展中的作用进行综述,并分析了靶向GALNT3开发抗肿瘤药物的前景与挑战。

乙酰半乳糖氨基转移酶3和维生素D受体基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的相关性研究

目的研究乙酰半乳糖氨基转移酶3(GALNT3)和维生素D受体(VDR)基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的关联性。方法纳入50例绝经后骨质疏松患者作为观察组,50例绝经后无骨质疏松志愿者作为对照组,检测两组女性的腰椎L2~L4、近端股骨颈和全髋骨密度(BMD),采用Taq Man基因分型技术检测GALNT3和VDR标签单核苷酸多态性(tag SNP),比较骨转换标志物(BTM)、血钙和磷水平,采用多因素Logistic回归分析筛选骨质疏松的危险因素。结果观察组GALNT33个位点和VDR 1个位点tag SNP百分比均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。观察组血清25-羟维生素D3[25-(OH)-D_3]、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(β-CTX)和血钙水平明显低于对照组,血磷水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。回归分析得出:4个tag SNP均是骨质疏松发生的独立危险指标。结论 GALNT3和VDR基因多态性与绝经后妇女骨质疏松密切相关。

子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶-3和N-乙酰半乳糖胺转移酶-6的表达水平及临床意义

目的探讨子宫内膜异位症(EMS)患者子宫内膜组织中多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶-3 (Gal NAc-T3)和N-乙酰半乳糖胺转移酶-6 (Gal NAc-T6)的表达水平及临床意义,为临床治疗提供参考依据。方法选择2016年1月-2018年1月在十堰市妇幼保健院进行手术且术后病理证实为EMS的58例患者,保留患者异位内膜和在位内膜组织,同时保留同时期进行腹腔镜手术且术后病理证实子宫内膜正常的35例患者正常内膜组织作为对照组。分别检测异位内膜组织、在位内膜组织及正常内膜组织中Gal NAc-T3、Gal NAc-T6 m RNA和蛋白表达水平,分析EMS不同分期患者异位内膜中Gal NAc-T3、Gal NAc-T6表达水平及其相关性。结果异位内膜组织中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6 m RNA相对表达量显著低于在位内膜组织和正常内膜组织,差异有统计学意义(P<0. 05);异位内膜组织中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6蛋白表达水平显著低于在位内膜组织,差异有统计学意义(P<0. 05),在位内膜组织中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6蛋白表达水平显著低于正常内膜组织,差异有统计学意义(P<0. 05);Ⅰ～Ⅱ期EMS患者异位内膜组织中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6 m RNA和蛋白表达水平均显著高于Ⅲ～Ⅳ期EMS患者(P<0. 05);EMD患者异位内膜组织中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6表达水平呈显著正相关关系(r=0. 662,P=0. 003)。结论 EMS患者异位子宫内膜中Gal NAc-T3和Gal NAc-T6表达水平显著降低,且呈显著正相关,可能与病情恶化有关。

α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和745C〉T突变的研究

目的通过对1个罕见的A3亚型家系进行分子遗传学分析，探讨α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因突变对于A抗原表达的影响。方法采用血型血清学方法对先证者及家系成员进行ABO血型鉴定，应用PCR产物直接测序和基因克隆法对ABO基因的第6、7外显子进行序列分析以及单倍型分析。结果先证者红细胞包含弱A抗原，同时血清中含有抗-A和抗-B抗体。直接测序结果显示ABO基因第6外显子存在261delG突变，第7外显子存在467C〉T和745C〉T两个杂合位点。基因克隆序列分析得到两个等位基因A307和001。A307基因序列与A101基因比对在第467位碱基为C〉T突变和第745位碱基为C〉T，导致多肽链P156L和R249W替换。结论α-1，3半乳糖基转移酶基因467C〉T和745C〉T突变产生A307基因型，导致A抗原表达减弱。

a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异导致Ael亚型

目的研究ABO基因的a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因变异对于A抗原表达的影响。方法通过标准血型血清学方法鉴定3份A亚型样本，应用聚合酶链反应一序列特异性引物扩增ABO基因第6、7外显子PCR产物直接测序及基因克隆测序等方法进行ABO基因分型及单倍型序列分析。结果3份A亚型样本的血清学检测结果均为Ael型，其中2份样本分别含有Ae108和001等位基因，1份样本含有Ae108和004等位基因。Ael08等位基因与A101等位基因相比，差异在第7外显子的467C〉T和804insG变异，导致多肽链P156L替换和269位氨基酸移框突变。结论a-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因467C〉T和804insG变异可能是Ael亚型分子基础之一。

PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究

在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列,针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础。

五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植的术前检测

目的本研究为了减少五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植手术的超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)和急性排斥反应(acute rejection,AR)发生率,进行全面术前检测。方法分别利用PCR技术和植物凝集素细胞染色对供体GGTA1基因敲除类型进行鉴定;30只藏酋猴分别与五指山小型猪进行淋巴细胞毒实验;供受体ABO血型鉴定。结果供体为GGTA1基因敲除猪,GTKO猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)植物凝集素细胞染色未检测出荧光,表明GGTA1基因敲除成功,与基因型鉴定结果一致。通过淋巴细胞毒实验选定28#与供体PBMC毒性最小的藏酋猴做为备选受体。血型鉴定显示供受体血型一致。结论通过对GTKO五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植的术前检测选定合适的受体,可有效减少异种移植HAR和AR的发生率。

一例ABO血型系统Aw43亚型的基因突变研究

目的研究1例AB0血型A亚型的分子机制。方法先证者及其家系成员（父母和姐姐）的AB0血型正反定型采用标准血清学技术。用PCR扩增先证者及其家系成员ABO基因的全部编码序列并进行双向测序分析。结果先证者红细胞与抗A呈现混合视野凝集，与抗B不凝集；其血清与A、0细胞均不凝集，与B细胞呈现凝集，血清学特性可定义为Aw亚型。ABO基因测序分析显示先证者1A／G、106G／T、188A／G、189C／T、220C／T、261G／del、297A／G、467C／T、646A／T、681A／G杂合。家系调查显示其母亲血清学表型特性和测序结果与先证者完全一致，其父亲基因型为B10I／002、姐姐为002／002。结合家系成员结果，可推断先证者AB0基因型中一个等位基因为002，另一个等位基因为新等位基因；它与A102相比存在1A＞G，导致起始密码子改变，已被红细胞血型基因数据库正式命名为Aw43。结论发现1例Aw43亚型，其α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因存在1A＞G和467C＞T变异。