人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性

目的克隆人3型副流感病毒(HPIV-3)HN基因,构建原核表达质粒,并检测表达蛋白的免疫原性。方法从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3RNA,用套式RT-PCR扩增HN基因,克隆至pGEM-T载体上,进行核苷酸序列分析,并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构,构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测后,进行纯化和复性。并以此蛋白免疫昆明小鼠,检测小鼠血清中HN抗体效价。结果扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95%,氨基酸序列同源性为97%,有16处发生了突变。截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序,证明构建正确。重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,且具有良好的反应原性。复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体。结论原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答。

抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定

目的制备抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为研发3型副流感病毒新型诊断试剂提供基础。方法利用重组克隆表达技术,获得可溶性的重组核衣壳蛋白;采用纯化的重组核衣壳蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人3型副流感病毒核衣壳单克隆抗体;采用ELISA及间接免疫荧光法筛选并鉴定可识别天然3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。结果获得9株分泌抗重组核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别天然的3型副流感病毒核衣壳蛋白。结论利用重组核衣壳蛋白作为免疫原制备出了识别天然核衣壳蛋白的单克隆抗体,并且具有较高的反应性。

人3型副流感病毒及其疫苗的研究进展

人3型副流感病毒(Human Parainfluenza Virus type 3,HPIV-3)是引起婴幼儿严重细支气管炎及肺炎等下呼吸道疾病的主要病原体,其在发达国家和发展中国家都造成了沉重的疾病负担。迄今,对HPIV-3感染的预防和治疗都还没有有效的疫苗和药物,因此WHO将HPIV-3疫苗列为未来重点研发的疫苗。近年来,随着重组技术和反向遗传学的发展,HPIV-3疫苗的研制取得了重要进展,部分疫苗已进入临床评价阶段。就HPIV-3的生物学特性如病毒结构特征、复制过程、流行病学特征,以及近年来传统冷适应减毒活疫苗、亚单位疫苗、以反向遗传学为基础的新型减毒活疫苗的研制成果及临床试验进展作简要综述。

人3型副流感病毒减毒活疫苗的研究进展

人副流感病毒(human parainfluenza viruses,HPIVs)是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要病原体,人3型副流感病毒(human parainfluenza viruses type 3,HPIV-3)是HPIVs中最主要的型别。目前尚无针对HPIVs的上市疫苗和有效的抗病毒药物,研发减毒活疫苗是目前开发HPIVs疫苗的方向。本文主要对HPIV-3减毒活疫苗的研究进展作一综述。

一起肉牛副流感病毒3型、巴氏杆菌、牛支原体混合感染的诊治

牛呼吸道综合征往往是多种病原体混合感染引起,致病机制复杂。云南省昆明市某肉牛养殖场部分犊牛出现了以咳嗽、气短、流鼻涕、腹泻等呼吸道症状为主要表现的呼吸道疾病,随后多头相继死亡,剖检主要病变为气管、胃黏膜、小肠出血,肺脏肝变,肝脏出血肿大,心脏出血,心包黏连等;经采病料用常见呼吸道疾病病原(牛病毒性腹泻病毒,牛冠状病毒,牛副流感病毒3型,牛呼吸道合胞体病毒,牛疱疹病毒1型,多杀性巴氏杆菌,溶血性曼氏杆菌,牛支原体)8联PCR检测试剂盒检测,结果为副流感病毒3型、多杀性巴氏杆菌、牛支原体混合感染。经用加米霉素、10%替米考星和20%氟苯尼考等大环内酯类药物治疗,结合加强饲养管理,多数病牛恢复了健康。

山羊副流感病毒3型的研究进展

山羊群中普遍存在山羊副流感病毒3型(CPIV3)病毒的感染,严重危害养羊业的健康发展。该文简要介绍了CPIV3的临床表现、流行病学、病原学、致病性、诊断技术、疫苗研发及防控技术等内容。研究表明,研制出安全有效的疫苗是控制山羊副流感病毒3型的方法,对预防由CPIV3引起的呼吸道疾病具有重要意义。

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道综合征的分析

为查明广西某牛场一起以呼吸道症状为主的病因,试验采用流行病学调查法、临床观察法、病理解剖观察法、病原分离培养和RT-PCR/PCR扩增法进行诊断,并对分离株进行药物敏感性试验。牛副流感病毒3型和牛支原体为阳性,牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等为阴性。该起病例由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起的,导致本场牛大批发病死亡的原因是由外购牛传染引起。

人3型副流感病毒兰州分离株LZ22全基因组序列的测定及分析

目的对人3型副流感病毒(HPIV-3)兰州分离株LZ22进行全基因组序列测定并分析。方法通过引物步移法和RACE技术测定LZ22株的全基因组核苷酸序列,并分析其基因组结构特点和进化地位。结果LZ22株的基因组全长15462个核苷酸,符合副黏病毒科基因组"6碱基原则",按照3′-NP-PP/C-M-F-HN-L-5′的顺序编码6种结构蛋白,基因结构与已知序列HPIV-3分离株相同。与GenBank登录的4株HPIV-3参考株进行同源性比对发现,LZ22株与ZHYMgz01株(中国广州)的同源性最高,为99.0%(147个核苷酸变异),与14702株(加拿大)的同源性最低,为94.6%(832个核苷酸变异)。系统进化分析表明,LZ22株与ZHYMgz01株为同一进化分支,与GP株(日本)进化关系次之,与14702株和JS株(美国)进化关系最远。结论LZ22株病毒基因组具有副黏病毒的遗传特征,核苷酸序列与HPIV-3有高度的同源性。HPIV-3的系统进化可能与地域相关。

人3型副流感病毒疫苗的研究进展

人3型副流感病毒是一种主要感染人类肺部上皮细胞的副黏病毒,可引起肺炎和支气管炎,在婴幼儿和免疫力低下的成人中有较高的发病率。经过多年的研究,对人3型副流感病毒疫苗的研究取得了重要的进展,但还没有有效的抗病毒药物和批准的疫苗上市。目前研究主要集中在减毒活疫苗及亚单位疫苗等,对人3型副流感病毒当前疫苗的研究情况做简要的综述。

牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究

目的针对黑龙江省近几年夏季奶牛经常发生以高热、气喘和流涎等症状为主的疾病,给畜牧业造成严重经济损失,本文旨在研究其病原因素及感染牛中和抗体的变化趋势。方法本研究采集爆发高热病的牛群中患病牛乳汁和鼻液进行病毒分离,经CPE和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及RT-PCR方法鉴定分离的病毒,最后应用病毒中和试验跟踪监测5头典型发病牛中和抗体13个月。结果从病料中分离到一种RNA病毒,能够产生典型的细胞融合样CPE,有囊膜和栅栏样纤突,但是没有血凝性,能够与参考毒株牛副流感病毒3型抗血清发生病毒中和反应,HN基因的序列分析发现与牛副流感病毒3型HN基因同源性最高达99.6%。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示康复期抗体效价是急性期的4倍以上,同时可见感染牛的中和抗体效价在6-8个月内能够维持在1:25～1:27,然后开始下降,最后维持在1:22～1:23之间。结论综上所述确定分离毒株是牛副流感病毒3型,进一步证实该病毒是引起本牛群高热病的病因之一,而且感染后中和抗体效价至少在6个月以内能够维持在较高的水平。

山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

2013年下半年至2014年3月,江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品,检测呼吸道相关病原,在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞,连续传代5代,经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒,命名为JS2013。扩增完整的M基因,进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型,具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP(rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105。间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgG1/κ。特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应。免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原。该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件。

C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定

为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1 056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。

牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。

牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型（BPIV3）双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）与兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1：25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为103TCID50。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P<0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。

北方三省(区)牛副流感病毒3型的血清学调查

为了解我国北方三省(区)牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染状况,从内蒙古、吉林、山西3个省采集牛血清样品482份。采用病毒中和试验方法进行BPIV3抗体检测。结果显示,482份血清中BPIV3阳性共439份,阳性率为91.08%。吉林、内蒙、山西3省区中血清BPIV3阳性率分别97.35%、84.31%、95.15%。研究表明,中国北方三省(区)牛群中普遍存在BPIV3的感染。