茶树β-1,3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的优化表达

从茶树中获得β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-glu)基因cDNA,发现其中存在着一些序列,它们与核糖体竞争性地结合pET32 a载体上的RBS位点,造成该基因cDNA在原核生物中很难表达。作者对其中的两处基因序列进行了突变,通过设计PCR引物,利用密码子的简并性,保证了突变后蛋白质的一级结构不变。使葡聚糖酶基因在大肠杆菌中明显表达。通过SDS-PAGE分析,证明表达产物分子量约75.8 kD,与预计大小一致,并通过水杨酸法对其进行酶活测定,证明其有活性。

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因导入甘蔗

将含有经过修饰的烟草(Nicotiana tabacumL.)Ⅰ类几丁质酶基因和Ⅰ类β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pCG-Ⅱ在农杆菌介导下转化甘蔗优良品种ROC10和ROC22,获得抗G418的转化植株52株,经PCR检测33株呈阳性;对部分经PCR检测呈阳性的转化植株进行Southern杂交和黑穗病抗病性的体外抑菌实验,结果显示这两个基因均已整合到部分甘蔗的基因组中,且它们对甘蔗黑穗病的抗性均有不同程度的提高。

β-1,3-葡聚糖酶及其在植物抗真菌病基因工程中的应用

β - 1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一 ,可由多种生物因子和非生物因子诱导产生。将外源 β - 1,3-葡聚糖酶基因导入植物 ,转基因植株显示出良好的抗真菌能力 ,是植物抗真菌病防治的有效新途径。研究表明 ,外源 β - 1,3-葡聚糖酶与其它防卫蛋白具有协同作用。本文对 β - 1,3-葡聚糖酶的诱导 ,分类及其与病原真菌分泌物之间的相互作用 ,转基因研究及协同表达等进行了评述。

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale)ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质 和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose 阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚 糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5．5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受 Hg2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等金属离子不同程度的抑制,Mn2+和Co2+对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数 Km为0．412 mg·mL-1,最大反直速度Vmax为3．876 U·mL-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑 菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝 生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡 聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。

转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因提高棉花对枯萎病和黄萎病的抗性

枯、黄萎病是世界棉花生产中的两大重要病害。传统育种缺乏抗源,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是植物防御体系中的两种防卫因子,两者之间存在协同增效作用。据此构建了4个单价和2个双价基因(分别定位于细胞内或细胞外)的植物表达载体,通过花粉管通道法转化棉花,经PCR和Southern杂交检测以及1996～2000年温室及病圃多代筛选鉴定,已培育出对枯、黄萎病抗性提高的转基因棉花株系。将抗病基因导入国产抗虫棉品种GK19中,还获得了兼抗病、虫的转基因优系。

不同碳、氮源组合对小麦全蚀病菌产生胞外β-1,3-葡聚糖酶的影响

利用改进的MS液体培养基,通过改变碳、氮源组合,分别在振荡培养小麦全蚀病菌7,14,21 d时(26℃,150 r/min),用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定培养滤液中的β-1,3-葡聚糖酶活性。结果表明,培养基中分别以小麦茎秆、叶片,玉米茎秆、叶片和根系为碳源与不同氮源组合,培养滤液中β-1,3-葡聚糖酶活性有明显差异,其中以小麦叶片为碳源时酶活性最高,以玉米根系为碳源时酶活性较低,但两者之间酶活性无明显差异。培养基中加入有机氮时酶活性均明显高于加入无机氮,但两种有机氮培养基中的酶活性变化趋势完全不同。以牛肉膏为氮源时,在小麦全蚀病菌培养7 d时培养滤液中的酶活性最高,且酶活性随病菌培养时间的延长而逐渐下降;以蛋白胨为氮源时酶活性则呈上升趋势,在病菌培养21 d时最高。以上结果表明,供试各组合中以牛肉膏为氮源、小麦叶片为碳源的组合为最佳组合,7 d时有相对较高的酶活性。

烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA在大肠杆菌中的表达

对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶（Ⅰｃｈｉｔｉｎａｓｅ，ⅠＣｈｉ）和β１，３葡聚糖酶（Ⅰｇｌｕｃａｎａｓｅ，ⅠＧｌｕ）ｃＤＮＡ分别构建了原核表达载体，并转化大肠杆菌ＢＬ２１。经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳＰＡＧＥ法证明表达产物ⅠＣｈｉ和ⅠＧｌｕ的分子量分别约为３０ｋＤａ和３１ｋＤａ，在菌内以包涵体形式存在。经包涵体的收集、洗涤、裂解和复性，两种表达产物在体外均表现出较强的抑病原真菌活性，且ⅠＣｈｉ的抑菌活力大于ⅠＧｌｕ。

烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA植物双价表达载体的构建及转化番茄的研究

将烟草中经修饰的Ⅰ类几了质酶和β－1，3-葡聚糖酶cDNA分别加上CaMV35S启动子和NOS终止子，依次插入到同一植物表达载体pBin19上，获得植物双价表达载体pCG－Ⅱ。然后载体pCG－Ⅱ以土壤农杆菌LBA4404介导转化番茄，再生植株的点杂交及PCR扩增证明两种cDNA已随T－DNA同时导入番茄植株中。

烟草品种Xanthi NN碱性β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与生物信息学分析

烟草碱性β-1,3-葡聚糖酶具有较强的抗真菌病害等作用。本研究根据烟草Samsun与抗真菌作用有关的碱性β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以烟草(Nicotiana tabacum)品种Xanthi NN基因组DNA为模板,进行PCR扩增,后将扩增产物与pUC57-T载体重组,再以该重组体转化大肠杆菌DH5α,在对阳性克隆进行鉴定后测序,并对其编码酶蛋白进行了一级、二级、三级结构及蛋白质同源性比较等生物信息学分析。研究结果表明,该基因全长1 868 bp,包含2个外显子和1个内含子;除终止密码子外,共编码359个氨基酸(GenBank登录号:EU867448)。该酶分子量为28.4 kDa,pI为9.72,是一个碱性蛋白;具有多个螺旋、转角、延伸链和无规卷曲等二级结构,其中α-螺旋占35.65%,β-转角占5.57%,延伸链占19.22%,无规卷曲占39.55%;三级结构同源建模预测显示,它与香蕉(Musa supientum)β-1,3-葡聚糖酶(PDB number 2cygA)具有60%的一致性;推测该酶蛋白与颠茄(Atropa belladonna)、马铃薯(Solanum tuberosum)等茄科植物的β-1,3-葡聚糖酶编码序列同源性分别达到89%和81%。本研究结果为进一步开展烟草抗真菌的β-1,3-葡聚糖酶的基因工程研究奠定了重要基础。

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白(PR蛋白),容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸(SA)对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理0.5、12、24、36、48和72 h后,提取RNA进行荧光定量检测β-1,3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)的表达量。结果表明,经诱导24 h后β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高,是未经SA诱导的1.8倍。根据前期已克隆的花生β-1,3-葡聚糖酶基因序列(GenBank JQ801335),在其5'端设计3个嵌套的特异性引物扩增其上游启动子序列。以花育20号基因组DNA为模板,利用TAIL-PCR方法,扩增得到973 bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子片段,在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400,并命名为Ah-Glu-Pro。PLACE和PlantCARE在线预测分析表明,Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还含有病原菌及水杨酸响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物,采用普通PCR法从花育20号扩增得到931 bp的启动子序列,命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Glu-P转化洋葱表皮细胞,经5 mmol/L SA诱导处理48 h后进行GUS染色。结果表明:经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色显示为蓝色,未经SA诱导的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色未显示蓝色,说明Ah-Glu-P是一个可被诱导的启动子,可能含有对SA响应的顺式调控元件。

生防木霉菌β-1,3-葡聚糖酶活性研究

通过采取还原糖法对生防木霉菌真菌2号和真菌4号菌株在不同发酵时间产β-1,3-葡聚糖酶活性进行测定,对其产β-1,3-葡聚糖酶特性进行初步研究。结果表明,同一菌株在不同发酵时间β-1,3-葡聚糖酶活性大小变化的趋势大致相同,并均在培养72 h时β-1,3-葡聚糖酶活性达到最大,在相同发酵时间,真菌2号菌株比真菌4号菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性要高。

β-1,3-葡聚糖酶产生菌的筛选及其产酶条件

为了制备β-1,3-葡聚糖酶,从土样中筛选出一株产β-1,3-葡聚糖酶活力较高的菌株LE02,经形态学观察,初步鉴定为木霉菌.木霉LE02在以2%的酵母粉为主的液体产酶培养基(起始pH 7.0)中,于32℃,150 r/min摇瓶培养60 h达到产酶高峰,酶活力可达71.09 U/mL.

β-1,3-葡聚糖酶的研究和应用

β-1，3-葡聚精酶的生产菌种由冻土毛霉经紫外线诱变获得，据正交试验确定培养条件。经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱层析，酶得到纯化，并对酶的性质进行了研究。酶对酵母自溶有明显促进作用，使自溶产物的游离氨基氮含量、还原糖含量、总蛋白质得率、干物质得率均得以提高。

葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析及表达

为验证葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄抗病防御机制中的作用,本研究以金星无核葡萄叶片为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到1个长度为1 244 bp的葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因。采用生物信息学方法对其开放读码框和理化性质进行分析,结果显示,该基因包含1个长度为1 083 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白质含360个氨基酸,分子量为89 440,理论等电点为4.83。系统进化分析结果显示,β-1,3-葡聚糖酶基因所编码的氨基酸序列与桃、豌豆和水稻的同源性分别为62.1%、60.8%和33.1%。定量PCR分析结果显示,在霜霉病菌侵染后的72 h内均可诱导该基因的表达,且表达量均高于对照,表明β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄应答霜霉病菌侵染过程中可能发挥一定作用。

pH值对巴西橡胶树胶乳β-1,3-葡聚糖酶结合黄色体膜的影响

基于黄色体内含物中的多种可溶性蛋白质以及黄色体膜在胶乳凝固中所起到的重要作用,已提出了多种阐明胶乳凝固机制的假说,但有关β-1,3-葡聚糖酶在胶乳凝固中的作用尚无报导。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)和免疫印迹技术(Western blotting),对不同pH值条件下破裂收集的黄色体内含物和膜组分中的蛋白质进行研究。结果表明,在pH5.5左右的酸性环境中,β-1,3-葡聚糖酶主要表现为可溶性蛋白质,很少结合黄色体膜;但在pH6.9左右的中性及偏碱性的环境下,大量β-1,3-葡聚糖酶结合到黄色体膜上,可溶性蛋白所占的比例很低。首次发现了β-1,3-葡聚糖酶可以结合黄色体膜,二者结合的程度明显受环境pH值的影响。该结果对于认识β-1,3-葡聚糖酶的生物功能,完善黄色体在胶乳凝固中的作用及阐明乳管堵塞机制具有重要意义。

几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究

采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。

粘帚霉GR-6菌株种类鉴定及其β-1,3-葡聚糖酶纯化与酶学性质

为明确粘帚霉GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶对植物病原真菌的作用机制,建立β-1,3-葡聚糖酶分离纯化体系,根据形态特征和ITS序列分析鉴定GR-6种类,用60%饱和度的丙酮沉淀酶蛋白质,再通过DE-52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶柱层析纯化蛋白质。结果表明,GR-6菌株ITS序列与粉红粘帚霉的相似度最高,达到98%,结合形态学特征将该菌株鉴定为粉红粘帚霉。SDS-PAGE显示纯化后得到一种分子量为4.11×104的蛋白质,该蛋白质具有β-1,3-葡聚糖酶活性。经该酶处理后的水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和棉花黄萎病菌(Verticilliun dahliae)菌丝颜色变浅、细胞轮廓变模糊、甚至菌丝细胞逐渐消失,可见,粉红粘帚霉GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶对这两种植物病原真菌菌丝有直接破坏作用。纯化后的β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4,酶液在50℃以下或pH 5时保存0.5 h,酶活性基本保持稳定;该葡聚糖酶对一些金属离子较敏感,其中Zn2+、Sn2+、Ca2+、Fe2+等使酶活性显著降低,而Mn2+和K+对酶活性没有明显的影响。建立的β-1,3-葡聚糖酶纯化体系稳定可靠。

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)和载体pET30a(+)上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。

转Bt+CpTI基因棉对烟粉虱种群动态影响及其几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化

本研究调查了转Bt+CpTI基因棉SGK321棉田、其亲本常规棉SY321棉田以及间作棉田烟粉虱成虫种群的数量,测定了不同时期SGK321棉与SY321棉叶片中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性及蛋白质的含量。结果表明:在整个生长期间,SGK321棉田烟粉虱的种群数量一直高于SY321棉田和间作棉田。烟粉虱取食的SGK321植株叶片几丁质酶活性呈下降-上升-下降-上升的趋势;SY321上部叶片中呈下降-上升-下降-上升的趋势,其下部叶片为先下降后上升趋势;SGK321叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性变化呈下降-上升-下降-上升趋势,而SY321叶片基本上均呈先下降后上升趋势;SY321与SGK321上部叶片中蛋白质相对含量均呈先上升后逐渐下降趋势,下部叶片与上部叶片相似但略有不同。SGK321与SY321处理植株叶片几丁质酶活性之间没有明显差异;SGK321处理植株叶片β-1,3-葡聚糖酶的活性多数时期高于SY321。探讨了棉花防御反应与棉田烟粉虱种群数量差异的相关性,以利于揭示双价抗虫棉对烟粉虱的影响及其生理防御机制,为烟粉虱的综合治理以及棉花育种等提供理论依据。