几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因导入甘蔗

将含有经过修饰的烟草(Nicotiana tabacumL.)Ⅰ类几丁质酶基因和Ⅰ类β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pCG-Ⅱ在农杆菌介导下转化甘蔗优良品种ROC10和ROC22,获得抗G418的转化植株52株,经PCR检测33株呈阳性;对部分经PCR检测呈阳性的转化植株进行Southern杂交和黑穗病抗病性的体外抑菌实验,结果显示这两个基因均已整合到部分甘蔗的基因组中,且它们对甘蔗黑穗病的抗性均有不同程度的提高。

烟草品种Xanthi NN碱性β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与生物信息学分析

烟草碱性β-1,3-葡聚糖酶具有较强的抗真菌病害等作用。本研究根据烟草Samsun与抗真菌作用有关的碱性β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以烟草(Nicotiana tabacum)品种Xanthi NN基因组DNA为模板,进行PCR扩增,后将扩增产物与pUC57-T载体重组,再以该重组体转化大肠杆菌DH5α,在对阳性克隆进行鉴定后测序,并对其编码酶蛋白进行了一级、二级、三级结构及蛋白质同源性比较等生物信息学分析。研究结果表明,该基因全长1 868 bp,包含2个外显子和1个内含子;除终止密码子外,共编码359个氨基酸(GenBank登录号:EU867448)。该酶分子量为28.4 kDa,pI为9.72,是一个碱性蛋白;具有多个螺旋、转角、延伸链和无规卷曲等二级结构,其中α-螺旋占35.65%,β-转角占5.57%,延伸链占19.22%,无规卷曲占39.55%;三级结构同源建模预测显示,它与香蕉(Musa supientum)β-1,3-葡聚糖酶(PDB number 2cygA)具有60%的一致性;推测该酶蛋白与颠茄(Atropa belladonna)、马铃薯(Solanum tuberosum)等茄科植物的β-1,3-葡聚糖酶编码序列同源性分别达到89%和81%。本研究结果为进一步开展烟草抗真菌的β-1,3-葡聚糖酶的基因工程研究奠定了重要基础。

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白(PR蛋白),容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸(SA)对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理0.5、12、24、36、48和72 h后,提取RNA进行荧光定量检测β-1,3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)的表达量。结果表明,经诱导24 h后β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高,是未经SA诱导的1.8倍。根据前期已克隆的花生β-1,3-葡聚糖酶基因序列(GenBank JQ801335),在其5'端设计3个嵌套的特异性引物扩增其上游启动子序列。以花育20号基因组DNA为模板,利用TAIL-PCR方法,扩增得到973 bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子片段,在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400,并命名为Ah-Glu-Pro。PLACE和PlantCARE在线预测分析表明,Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还含有病原菌及水杨酸响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物,采用普通PCR法从花育20号扩增得到931 bp的启动子序列,命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Glu-P转化洋葱表皮细胞,经5 mmol/L SA诱导处理48 h后进行GUS染色。结果表明:经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色显示为蓝色,未经SA诱导的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色未显示蓝色,说明Ah-Glu-P是一个可被诱导的启动子,可能含有对SA响应的顺式调控元件。

葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析及表达

为验证葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄抗病防御机制中的作用,本研究以金星无核葡萄叶片为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到1个长度为1 244 bp的葡萄β-1,3-葡聚糖酶基因。采用生物信息学方法对其开放读码框和理化性质进行分析,结果显示,该基因包含1个长度为1 083 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白质含360个氨基酸,分子量为89 440,理论等电点为4.83。系统进化分析结果显示,β-1,3-葡聚糖酶基因所编码的氨基酸序列与桃、豌豆和水稻的同源性分别为62.1%、60.8%和33.1%。定量PCR分析结果显示,在霜霉病菌侵染后的72 h内均可诱导该基因的表达,且表达量均高于对照,表明β-1,3-葡聚糖酶基因在葡萄应答霜霉病菌侵染过程中可能发挥一定作用。

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)和载体pET30a(+)上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。

小麦根腐离蠕孢菌诱导小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其表达

为了明确小麦受小麦根腐离蠕孢侵染后β-1,3-葡聚糖酶基因的表达情况,采用RT-PCR方法在受小麦根腐离蠕孢菌侵染后的小麦叶片中扩增β-1,3-葡聚糖酶基因,然后对侵染后的小麦叶片总RNA进行Northern斑点杂交。结果表明,克隆到了β-1,3-葡聚糖酶基因,该基因在小麦被侵染12 h时开始表达,在48 h后未见表达。对照中未见表达。可推断出此β-1,3-葡聚糖酶基因是被小麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokinianum)侵染后诱导表达的。

基因枪介导外源基因转化棉花幼胚方法的研究

以棉花幼胚作为外源基因转化的受体,用基因枪法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pBIBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。基因枪转化处理的幼胚经卡那霉素(Kan)筛选培养,已获得了抗性植株。研究表明用基因枪法转化处理棉花幼胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入幼胚,因而避开了植株离体再生的困难。

几丁质酶基因在转基因烟草中表达效率的检测

采用氨基葡萄糖法检测转基因烟草植株叶片几丁质酶活力 ,结果表明几丁质酶基因在转基因植株中酶活力增强 ,与 β - 1 ,3-葡聚糖酶基因的协同作用下酶活性最强 ,几丁质酶活力的测定对外源基因表达效率的检测是可行的 .